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Mar 14, 2023

Des interventions optogénétiques et pharmacologiques relient les neurones à hypocrétine à l'impulsivité chez la souris

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 6, Article number: 74 (2023) Citer cet article

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Les neurones de l'hypothalamus latéral exprimant le neuropeptide hypocrétine, également connu sous le nom d'orexine, sont des modulateurs critiques connus de la stabilité de l'éveil. Cependant, leur rôle dans les différentes composantes du construit d'excitation telles que l'attention et la prise de décision est mal compris. Ici, nous étudions la dynamique du circuit neuronal de l'hypocrétine lors de l'impulsivité de l'action d'arrêt dans une tâche Go/NoGo chez la souris. Nous montrons que l'activité neuronale de l'hypocrétine est en corrélation avec l'anticipation de la récompense. Nous avons ensuite évalué le rôle causal de l'activité neuronale de l'hypocrétine en utilisant l'optogénétique dans une tâche Go/NoGo. Nous montrons que la stimulation des neurones hypocrétines pendant la période de repère augmente considérablement le nombre de réponses prématurées. Ces effets sont imités par l'amphétamine, réduits par l'atomoxétine, un inhibiteur de l'absorption de la noradrénaline, et bloqués par un antagoniste sélectif du récepteur 1 de l'hypocrétine. Nous concluons que les neurones hypocrétines ont un rôle clé dans l'intégration des stimuli saillants pendant l'éveil pour produire des réponses appropriées et opportunes aux signaux gratifiants et aversifs.

Les hypocrétines (Hcrts), également appelées orexines, sont deux neuropeptides dérivés du même précurseur1,2. Les neurones qui produisent les peptides Hcrt sont limités à la zone hypothalamique latérale, mais leurs projections s'étendent largement dans tout le cerveau3. Des études antérieures ont montré que l'intégrité du système Hcrt est essentielle pour la stabilité de l'excitation ; la perte de neurones Hcrt chez le chien, la souris et l'homme entraîne une narcolepsie avec cataplexie. On pense que cette stabilité s'exerce en intégrant plusieurs variables des connexions hypothalamiques locales ainsi que des afférences de l'hippocampe, du septum et de l'amygdale4.

En plus du rôle démontré dans les transitions d'état d'éveil, de multiples sources de données ont placé le système hypocrétine/orexine comme un relais important dans le traitement de la récompense cérébrale5,6. Nous et d'autres avons montré que l'antagonisme Hcrt R réduit la motivation à rechercher une récompense7 et bloque la réintégration du stress dans la recherche de cocaïne8,9. Cet effet est probablement dû à une augmentation durable de l'excitabilité dopaminergique provoquée par la libération de Hcrt10,11,12 via la signalisation HcrtR113,14.

L'impulsivité, souvent définie comme une action sans prévoyance ni souci des conséquences, est une caractéristique essentielle de nombreux troubles psychiatriques, dont la toxicomanie et le trouble bipolaire15,16. Une caractéristique commune importante de l'excitation et de la dépendance réside dans l'intégration de signaux saillants pour prendre des décisions appropriées axées sur les objectifs. Nous avons précédemment montré que l'activité des neurones Hcrt est corrélée à l'exposition à des stimuli de valence positive et négative17,18. Cependant, on ne sait pas si l'activité Hcrt provoquée par ces stimuli a un effet sur la prise de décision. Ici, nous avons étudié le rôle de l'activité Hcrt dans la prise de décision et l'impulsivité d'action en modulant le système Hcrt à l'aide de la pharmacologie et de l'optogénétique lors d'une tâche Go/NoGo établie.

Nous avons utilisé la photométrie des fibres pour surveiller l'activité des neurones Hcrt dans une tâche Go/NoGo. Nous avons formé des souris knockin Hcrt-IRES-cre18 à la tâche Go/NoGo avec une précision allant jusqu'à 70 %, infusé un vecteur viral codant pour GCamp6f et implanté une fibre optique dans l'hypothalamus latéral (Fig. 3 supplémentaire). Nous avons enregistré l'activité neuronale Hcrt tout au long de la tâche Go/NoGo et analysé hors ligne le changement de signal pendant les transitions entre les phases de la tâche (Precue, Go et NoGo Cues, Reward, ITI). Comme le montrent les Fig. 1A et D, les réponses calciques avaient tendance à augmenter lors de la transition entre les périodes de pré-signal et de signal, en particulier chez les animaux qui répondaient correctement au signal Go (Time x Transition Interaction F(1,4) = 2,69, p = 0,10 ). Les tracés Correct Go étaient significativement différents de Precue (Fig. 1D ; p = 0,03). Ce signal contraste avec les faibles niveaux d'activité observés pendant la période NoGo Cue (Fig. 1B). Les animaux qui avaient des réponses incorrectes ont montré des différences modérées mais significatives dans les signaux de calcium lors de l'exposition aux signaux, ce qui correspond à une réponse aux stimuli saillants18. Les signaux de calcium ont progressivement augmenté au cours de la période Go Cue et ont atteint des niveaux maximaux coïncidant avec la livraison d'une récompense (Fig. 1B) (Temps F (1,4) = 9,27, p = 0,04). En revanche, le profil d'activité calcique des neurones Hcrt est resté faible pendant le signal NoGo, mais a également montré un pic immédiatement après le nez. La transition de la récompense à la fin de l'essai dans la période inter-essai a également montré un pic d'activité (Fig. 1C, F) (Temps F(1,4) = 7,88, p = 0,048), mais les deux Correct Les groupes Go et NoGo ont montré des réponses similaires (Time x Transition F(1,4) = 0,007, p = 0,94). Aucun signal fluorescent n'a été détecté chez les souris de type sauvage (Hcrt-IRES-cre-) (Fig. 1 supplémentaire).

Moyenne ΔF/F des neurones Hcrt 5 s avant et 5 s après (A, D) Precue to Cue, (B, E) Cue to Reward, ou (C, F) Reward to ITI transitions dans la tâche Go/NoGo. A–C Time 0 et la ligne pointillée verticale indiquent le point de transition. La teinte de couleur indique la réponse des animaux dans la tâche Go/NoGo. La région ombrée représente SEM La rangée inférieure (D – F) affiche le signal moyen pendant les 1 s avant et 1 s après la transition étiquetée ci-dessus. *indique la différence entre les groupes (test de Bonferroni, p < 0,05).

Pour déterminer si le pic d'activité Hcrt était causal à une action impulsive, nous avons utilisé la stimulation optogénétique des neurones Hcrt pendant les 5 premières secondes des signaux Go et NoGo. Nous avons choisi des paramètres compatibles avec les enregistrements in vivo de neurones Hcrt19 à 5 et 10 Hz. La stimulation pendant le signal Go n'a pas affecté de manière significative le nombre de réponses (P> 0, 05) (Fig. 2A). Cependant, la stimulation Hcrt pendant le signal NoGo a considérablement réduit la probabilité d'essais NoGo corrects (p <0, 001 RM-ANOVA avec des comparaisons multiples de Bonferroni) (Fig. 2B; Films supplémentaires 1 et 2). Fait intéressant, la stimulation optogénétique de Hcrt pendant la période de pré-signalisation a également augmenté les réponses prématurées chez les animaux Hcrt-cre, mais pas chez les souris témoins de type sauvage (P> 0, 05, RM-ANOVA) (Fig. 2C). Ces résultats suggèrent fortement que les neurones Hcrt répondent aux signaux saillants associés à une récompense et que l'activité est supprimée si une inhibition comportementale est requise.

Les effets de la stimulation optogénétique à 5 ou 10 Hz des neurones Hcrt sur le comportement Go/NoGo. Une stimulation Hcrt n'a aucun effet sur la probabilité d'une réponse Go correcte mais (B) réduit la probabilité d'une réponse NoGo correcte et (C) augmente le taux de réponse precue. Les effets ne sont pas observés dans les contrôles Hcrt-cre- (gris). La couleur indique le génotype et la teinte indique la fréquence laser. * indique la différence par rapport aux essais témoins No-Laser au sein du même génotype (test de Bonferroni, p < 0,05) et † indique la différence par rapport aux témoins Hcrt-cre- à cette fréquence laser particulière. Les boîtes à moustaches indiquent les moyennes et l'écart type. Les moustaches couvrent les valeurs maximales et minimales.

Hcrt exerce son action sur deux GPCRS qui se lient différemment à Hcrt1 et Hcrt2. Des études chez des animaux knock-out indiquent que les signalisations HcrtR1 et HcrtR2 affectent la stabilité sommeil/éveil20, tandis que HcrtR1 module les effets sur la fonction de récompense cérébrale21. Nous avons donc utilisé un antagoniste sélectif de HcrtR1 pour tester si la signalisation HcrtR1 est nécessaire pour l'effet de Hcrt sur l'impulsivité.

Pour calibrer l'effet des antagonistes HcrtR1, nous avons évalué les réponses des animaux sur la tâche Go/NoGo suite à des injections de différentes doses d'amphétamine (Figs. 3A, D, G), (1 et 2,5 mg délivrés 10 min avant le dosage, un psychostimulant connu pour augmenter le choix impulsif 22 ou l'atomoxétine (Fig. 3B, E, H), un inhibiteur de la recapture noradrénergique qui améliore les performances dans la tâche Go/NoGo 23. En effet, le traitement par amphétamine, dose-dépendante, réduit la probabilité NoGo (P < 0,05 RM- ANOVA) (Fig. 3D), alors que l'atomoxétine a légèrement amélioré les performances des souris (P < 0,05 RM-ANOVA) (Fig. 3B, H). De même que l'atomoxétine, l'antagoniste sélectif de HcrtR1 a augmenté de manière dose-dépendante la probabilité No Go et réduit le Taux de réponse pré-cue (P <0,05 RM-ANOVA) (Fig. 3F, I).

L'amphétamine diminue le taux de réponse correcte NoGo (D) et augmente le taux de réponse PreCue (G), mais n'altère pas le taux de réponse correcte Go (A). En revanche, l'atomoxétine augmente le taux de réponse Go correct (B) et diminue le taux de réponse PreCue (H), mais ne modifie pas le taux de réponse NoGo correct (E). L'antagonisme sélectif HcrtR1 diminue le taux de réponse Go correct (C) et le taux de réponse PreCue (I) et augmente le taux de réponse NoGo correct (F). Les données sur le véhicule sont partagées entre les groupes amphétamine et atomoxétine (livraison IP), tandis que les données sur l'antagoniste HcrtR1 sont comparées au véhicule délivré dans la même modalité (gavage oral). * indique la différence entre le traitement du véhicule (test de Bonferroni, p < 0,05). Les boîtes à moustaches indiquent les moyennes et l'écart type. Les moustaches couvrent les valeurs maximales et minimales.

Nous avons ensuite comparé les réponses opérantes dans un paradigme Go/NoGo après une stimulation optogénétique de Hcrt et un traitement pharmacologique systémique avec de l'amphétamine (Fig. 4A, D, G), de l'atomoxétine (Fig. 4B, E, H) ou un antagoniste sélectif de HcrtR1 (Fig. .4C, F, I). La probabilité de réponses prématurées au cours de la période préCue a été augmentée par l'administration systémique d'amphétamine, de la même manière que la stimulation neuronale Hcrt (Fig. 4G) (P <0, 05 effets principaux du traitement, génotype dans RM-ANOVA à deux voies). En revanche, le traitement par l'atomoxétine, un inhibiteur de l'absorption noradrénergique connu pour augmenter l'attention et diminuer l'impulsivité24, a partiellement récupéré les effets de la photostimulation Hcrt (Fig. 4E, H) (P < 0,05 effets principaux et interaction du traitement et du génotype dans le RM bidirectionnel -ANOVA). L'antagoniste HcrtR1 a complètement récupéré l'augmentation des réponses prématurées provoquées par la stimulation Hcrt (Fig. 4F) (P < 0, 05 effets principaux et interaction du traitement et du génotype dans l'ANOVA RM bidirectionnelle).

Les effets de la stimulation Hcrt à 10 Hz en même temps que l'administration d'amphétamine (A, D, G), d'atomoxétine (B, E, H) ou d'un antagoniste HcrtR1 (C, F, I) à différentes doses sur le taux de réponse Go correct (A, B, C, stimulation délivrée pendant les 5 premières s de la période de repère Go), taux de réponse NoGo correct (D, E, F, stimulation délivrée pendant les 5 premières s de la période de repère NoGo) et taux de réponse PreCue (G, H, I, stimulation délivrée au cours des 5 dernières s de la période PreCue) sont affichés. La couleur indique le génotype (violet pour hcre-cre+ et gris pour les contrôles) et l'ombre indique le dosage (plus foncé pour les dosages plus élevés). Les données sur le véhicule sont partagées entre les groupes amphétamine et atomoxétine (livraison IP), tandis que les données sur l'antagoniste HcrtR1 sont comparées au véhicule délivré dans la même modalité (gavage oral). * indique la différence par rapport au véhicule au sein du même génotype (test de Bonferroni, p < 0,05) ; † indique la différence par rapport aux témoins Hcrt-cre- à cette dose particulière (test de Bonferroni, p < 0,05).

L'impulsivité, qui conduit à une prise de décision altérée, est associée à de nombreux troubles psychiatriques et comportementaux, tels que le trouble déficitaire de l'attention/hyperactivité, les troubles de l'alimentation et de la toxicomanie25,26,27. Plusieurs études ont établi une relation entre la consommation de caféine, la perte de sommeil, les comportements à risque et l'impulsivité28,29, bien que les mécanismes neuronaux de ces relations soient inconnus. La loi Yerkes-Dodson stipule qu'il existe une relation entre l'excitation physiologique et la performance jusqu'à un certain point, où un excès d'excitation conduit à de mauvaises performances. En effet, il existe des preuves que l'hypoexcitation chez les patients narcoleptiques déficients en Hcrt entraîne des déficits d'attention30. Ici, nous avons utilisé une tâche Go/NoGo pour évaluer les performances et le comportement d'impulsivité motrice chez la souris et testé si l'excitation provoquée par le neuropeptide Hcrt suivait la loi de Yerkes-Dodson. Nous montrons que l'hyperexcitation induite par la stimulation optogénétique des neurones Hcrt à des fréquences compatibles avec leur profil d'activité phasique diminue également les performances d'attention.

L'impulsivité accrue causée par l'activité Hcrt est cohérente avec d'autres rapports montrant une diminution de l'impulsivité pour la cocaïne lors d'un traitement au suvorexant, un double antagoniste HcrtR33. Les neurones Hcrt semblent être activés par une pléthore de stimuli saillants de valences positives et négatives17,18. Ainsi, l'activité Hcrt peut être interprétée comme un signal d'alerte/d'urgence qui engage rapidement les circuits d'excitation monoaminergiques. En utilisant cFos, Freeman et al. 34 ont montré une activation des neurones Hcrt hypothalamiques médians, mais pas latéraux, corrélée avec une plus grande précision sur la tâche Go/NoGo. La faible résolution temporelle de l'immunoréactivité cFos (60 min après la session Go/NoGo) empêche les comparaisons directes avec nos études. Une limitation de nos résultats est que le placement exact de la canule n'a pas pu être vérifié anatomiquement en raison de la mauvaise qualité des tissus. Nous avons cependant testé un placement précis avant les expériences optogénétiques en surveillant les transitions veille/sommeil après une stimulation à 10 Hz. Cette méthode s'est avérée extrêmement fiable dans nos précédents travaux17. Nous avons également vérifié l'exactitude des conditions d'injection et l'expression eutopique des transgènes chez de nouveaux animaux (Fig. 2 et 3 supplémentaires).

Quel mécanisme pilote l'impulsivité suscitée par les neurones Hcrt ? Les circuits neuronaux sous-jacents Go/NoGo ont été associés à la fois à l'intégrité fonctionnelle et structurelle des systèmes cérébraux connus pour être compromis dans la dépendance aux stimulants chez les humains35,36 et les rongeurs26,27. La capacité d'inhiber les actions après la formation d'une habitude a été classiquement liée aux boucles neuronales entre la zone tegmentale ventrale (VTA) et la coque du noyau accumbens (NAcc) ainsi qu'aux boucles corticostriatales. Cependant, la façon dont ces structures sont modulées par l'éveil et l'attention est encore mal comprise. Les interactions entre la coque NAcc et le VTA ont été proposées comme substrat principal de l'impulsivité d'attente, par laquelle les neurones VTA se projettent sur les cellules GABAergiques dans la coque NAcc, qui se projettent vers les interneurones GABA dans le VTA. Une réponse prématurée impulsive est associée à une diminution de la libération de dopamine dans le noyau et à une augmentation de la libération de dopamine dans la sous-région de la coquille37. Des preuves substantielles montrent des connexions réciproques entre Hcrt, les neurones contenant des récepteurs D2 dans la coquille NAcc et le VTA. Hcrt1 augmente la décharge des neurones latéraux et médiaux de la coquille NAcc38. Récemment, Gonzalez et al. 39, ont montré que les neurones Hcrt augmentaient l'activité lors de l'approche de la nourriture, et cette activité diminuait à la ligne de base au début du comportement de consommation, médiée par des interactions réciproques entre la coque des neurones NAcc et Hcrt. Les réponses Go correctes réduites observées après le traitement d'un antagoniste de Hcrt R1 (Fig. 2C) sont peu probables en raison d'une somnolence accrue20, puisque les souris knock-out Hcrt R1 ont un phénotype de sommeil léger ; au lieu de cela, ces souris indiquent que HcrtR1 est nécessaire pour une réponse, une motivation ou les deux renforcées par la nourriture21. Blomley et al. 40 ont décrit un circuit excitateur direct Hcrt→D2 et ont montré que l'activité des cellules D2 est nécessaire pour l'évitement inné du risque dépendant de Hcrt chez la souris40. La dynorphine, qui est co-libérée par Hcrt + dans la LH, inhibe la majorité des neurones dopaminergiques médiaux de la coque NAcc et de l'amygdale basolatérale, mais ne réduit le déclenchement que dans une petite fraction de ceux qui se projettent sur la coque latérale NAcc. L'activation des récepteurs opioïdes Kappa a été suggérée pour augmenter l'impulsivité dans le 5CSRRT41. Notre stimulation optogénétique des neurones Hcrt peut avoir augmenté la libération de Dynorphine42,43. Ainsi, il est concevable que des changements dans le rapport E/I provoqués par la libération de Hcrt dans la coquille NAcc puissent provoquer des réponses prématurées soit en se liant aux récepteurs Hcrt sur les neurones D2 ou les interneurones NPY +. Il est à noter que l'effet neuromodulateur de Hcrt dans le NAcc semble être spécifique, car l'activation chimiogénétique des neurones VTA n'affecte pas l'impulsivité44,45. L'activité Hcrt peut également modifier l'équilibre E/I des sorties hypothalamiques : l'excitation des neurones LH(GAD65) induit une activité locomotrice élevée, tandis que l'inhibition de l'activité naturelle des neurones LH(GAD65) déprime la locomotion volontaire46. Le circuit Hcrt → LH(GAD65) peut donc aider à créer l'envie de courir, reflétée dans le test Go/NoGo en tant que réponses prématurées accrues.

En plus du circuit de coque canonique VTA → NAcc, la stimulation optogénétique Hcrt active le locus coeruleus (LC)47, une structure également impliquée dans le comportement impulsif médié par la libération de noradrénaline dans le cortex préfrontal (PFC)48 ou le NAcc49. La libération de norépinéphrine (NE) dans la coquille NAcc joue un rôle important dans les effets de l'atomoxétine sur l'impulsivité, tandis que la NE dans le PFC atténue les effets de l'amphétamine sur le comportement impulsif. Étant donné que la stimulation optogénétique Hcrt n'a pas modifié les effets de l'amphétamine sur l'impulsivité, NE semble moduler l'action Hcrt dans le NAcc.

En utilisant la photométrie des fibres, nous avons montré que l'activité neuronale Hcrt dans l'hypothalamus latéral culmine au moment de délivrer une récompense dans les essais Go, ce qui est cohérent avec les 74 % de neurones signalés augmentant leur taux de déclenchement dans les enregistrements globaux d'une tâche de choix50. Des études récentes de Burdakov et al. 46 et notre propre laboratoire17 indiquent que les neurones Hcrt sont sensibles à de multiples stimuli saillants et l'augmentation de la concentration de Ca2+ pendant la séance de Go peut refléter une telle saillance (Fig. 1). Des profils de photométrie similaires ont été observés lors de l'enregistrement des réponses des neurones noradrénergiques TH + dans le Locus coeruleus, une structure cérébrale impliquée de manière critique dans l'attention. Des travaux antérieurs de notre laboratoire ont montré que les neurones Hcrt se projettent de manière dense vers LC et que le blocage optogénétique de l'activité neuronale LC empêche les transitions sommeil-éveil induites par Hcrt47. Les profils de photométrie des neurones Hcrt et LC étaient également similaires lorsqu'ils étaient enregistrés lors d'essais NoGo corrects et lors de réponses prématurées lors de sessions NoGo. La connexion HcrtLC est probablement signalée par les récepteurs HcrtR1 en fonction de leur modèle d'expression rapporté dans le LC51,52. En conséquence, les antagonistes de HcrtR1 ont pu réduire les réponses prématurées provoquées par l'amphétamine.

Le TDAH se caractérise par un niveau d'inattention, d'impulsivité et/ou d'hyperactivité inapproprié au développement, et l'atomoxétine et d'autres stimulants ont été utilisés pour traiter les adultes atteints de ce trouble53. En effet, nous montrons ici que l'atomoxétine, un inhibiteur de l'absorption noradrénergique, restaure partiellement les réponses normales suite à l'impulsivité provoquée par la stimulation optogénétique Hcrt. Un antagoniste sélectif de Hcrt R1 est apparu plus efficace pour sauver la probabilité de comportement inhibiteur dans le test d'impulsivité, suggérant une application clinique possible dans le traitement des troubles psychiatriques avec impulsivité inadaptée.

Ici, nous avons démontré une relation causale entre l'activation des neurones Hcrt et l'impulsivité d'attente et d'arrêt. La stimulation optogénétique des neurones Hcrt a augmenté les réponses prématurées dans les essais NoGo, alors qu'un antagoniste sélectif de HcrtR1 a réduit l'effet de l'amphétamine sur une tâche Go/NoGo. Cet effet est probablement médié par des mécanismes dopaminergiques et noradrénergiques dans le striatum et le PFC. La robustesse et la spécificité des antagonistes de HcrtR1 sur cette tâche en font d'excellents outils pharmacologiques pour traiter le TDAH et d'autres troubles associés à l'impulsivité.

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives du US National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et ont été approuvées par le comité administratif de l'Université de Stanford sur les soins aux animaux de laboratoire (protocole ID # 18787).

Les animaux ont reçu chaque médicament/dose dans un ordre aléatoire pour se protéger contre les effets d'ordre, avec au moins 3 jours entre les jours de traitement pour permettre un lavage suffisant. Le chlorhydrate d'atomoxétine a été obtenu auprès de Sigma (Y0001586) et a été dissous dans du NaCl à 0,9 % (solution saline) qui a été administré par injection intrapéritonéale à une dose de 5 mg/kg ou de 10 mg/kg 30 min avant le début du Go/NoGo test. L'hémisulfate de D-amphétamine a été obtenu auprès de Sigma (A5880) et a été dissous dans du NaCl à 0,9 % (solution saline) qui a été administré par injection intrapéritonéale à une dose de 1 mg/kg ou de 2,5 mg/kg 10 minutes avant le début de la phase Go/ test NoGo22,54). De plus, un antagoniste HcrtR1 a été obtenu auprès de Boehringer Ingelheim (brevet WO2017/178339) et a été dissous dans 0,5 % d'hydroxyéthylcellulose (Sigma, 525944) et 0,015 % de Tween 80 (Sigma, P1754) dans de l'eau qui a été administrée par gavage oral à une dose de soit 2,5 mg/kg, 7,5 mg/kg ou 12,5 mg/kg. En plus des 7 groupes médicament/dose, deux groupes témoins ont été inclus dans lesquels les souris ont reçu soit une injection intrapéritonéale de solution saline 10 min avant le début du test Go/NoGo, soit la solution véhicule utilisée pour administrer le composé HcrtR1 par voie orale. gavage 60 min avant le début du test Go/NoGo.

Des souris hétérozygotes mâles Hcrt-IRES-Cre knock-in (Hcrt-cre +) rétrocroisées sur le fond C57BL6J (N9) ont été élevées en interne, avec des compagnons de portée de type sauvage (Hcrt-cre-) utilisés comme témoins. Les souris ont été logées en groupes de cinq souris maximum dans des chambres en plexiglas avec une température (22 ± 1 ˚C), une humidité (40–60 %) et des conditions d'éclairage stables (9h00–21h00 sombre ; 9 : 00 pm–9:00 am light). Au moment du début de l'entraînement, les souris pesaient environ 27 g. Au cours de la formation, les souris ont été transférées vers un paradigme de restriction de l'eau, dans lequel elles ont eu accès à de l'eau pendant 2 à 4 h à la fin de leur période active. Tous les entraînements, enregistrements et manipulations ont eu lieu pendant la période sombre.

Les souris ont été anesthésiées avec un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (20 mg/kg) et montées sur un cadre stéréotaxique animal (David Kopf Instruments) et ont reçu des injections de 0,3 μl d'AAV-DJ-EF1α-DIO-hChR2( H134R)-virus eYFP (2,5 × 1012 copies du génome par ml, Stanford Virus Core) dans l'hypothalamus latéral droit ou gauche (LH) (AP : − 1,35 mm, ML : ± 0,95 mm, DV : −5,15 mm) avec un 5 μl de microseringue Hamilton. Une fibre de verre (200 μm de diamètre, lentilles doriques, Franquet, Québec, Canada) a été implantée avec la pointe juste au-dessus du site d'injection pour des stimulations optogénétiques. Pour la photométrie des fibres, 0,3 μl de vecteurs AAV portant des gènes codant pour GCaMP6f (AAV-DJ-EF1α-DIO-GCaMP6f, 1,1 × 1013 copies de génome par ml, Stanford Virus Core) ont été délivrés à droite ou à gauche LH (AP : -1,35 mm, ML : ± 0,95 mm, DV : −5,15 mm) avec une micro-seringue Hamilton de 5 μl, et une fibre de verre (diamètre de 400 μm, 0,48 NA, lentilles doriques) a été implantée avec la pointe au site d'injection pour une acquisition ultérieure du signal GCaMP6f . Les souris Hcrt-cre+ et Hcrt-cre- (contrôle) ont reçu un traitement viral identique.

Les animaux ont d'abord été entraînés pour savoir où se produit la remise des récompenses en étant entraînés selon un programme d'intervalle aléatoire de 60 s jusqu'à ce qu'ils enquêtent de manière fiable sur le port de récompense des coups de nez (> 200 coups de nez par session) et de façon fiable pendant la période de récompense ( jusqu'à ce que ~80 % des périodes de récompense aient montré au moins un coup de nez). Suite à cela, les souris ont été formées sur le « Go Cue » dans une session de 40 minutes ou de 60 essais (selon la première éventualité) d'essais Go Cue uniquement. Une fois que les souris ont répondu de manière fiable au Go Cue (> 70 % de réponse précise au Go Cue sur trois jours d'entraînement consécutifs), le "NoGo Cue" a été introduit afin que la session d'essai de 40 min/60 soit une distribution aléatoire de 50 % d'essais Go et 50 % d'essais NoGo. Une fois que les souris ont répondu de manière fiable et précise aux signaux Go et NoGo (> 70 % de réponses correctes aux signaux sur trois jours de formation consécutifs), les souris ont été considérées comme prêtes pour le test. Une précision fiable a été maintenue entre les jours de test avec un entraînement régulier (au moins 5 jours par semaine) - les souris n'ont été testées que si leur dernière session d'entraînement a montré une précision > 70 % aux signaux Go et NoGo (Fig. 5).

Après une période de précue de longueur variable (durée 9 à 24 s, lumière de la cage allumée), les périodes Go et NoGo (durée 10 s ou jusqu'à ce que nosepoke, lumière de la cage allumée) soient signalées à l'animal via un signal auditif distinct. ITI signifie intervalle inter-essais (durée 10 s, lumière de la cage éteinte). Les réponses prématurées pendant la période de pré-cue et les réponses incorrectes pendant la période de repère déclenchent la progression vers l'ITI, tout comme la conclusion de la période de récompense (durée 3 s, lumière de la cage allumée). Les cases grisées indiquent des réponses incorrectes.

Les paramètres suivants ont été calculés par session : Hits : le nombre de fois qu'un animal produit un coup de nez pendant la période de repère d'un essai de Go dans une session particulière ; Fausses alarmes : le nombre d'essais NoGo sur lesquels l'animal a produit un coup de nez pendant la période de repère NoGo ; Taux de réponse PreCue : le nombre total de réponses effectuées pendant toutes les périodes de pré-cue et est divisé par la durée totale de toutes les périodes de pré-cue. Si aucun poke ne s'est produit pendant la présentation de la cue, la valeur est définie sur la latence maximale (durée maximale de présentation de la cue).

Pour un enregistrement par fibre-photométrie, les souris Hcrt-cre+ et Hcrt-cre- ont été connectées à un câble d'enregistrement flexible et placées dans la chambre opérante. Là, leur signal GCaMP6f a été enregistré pendant 12 min, 1 min d'enregistrement de référence pendant que la souris se reposait dans la cage opérante sans tâche en cours d'exécution, puis 10 min d'essais Go/NoGo (rapport 50:50 des essais Go à NoGo) , suivi d'une minute supplémentaire d'enregistrement post-session. Les enregistrements ont été capturés à l'aide d'un équipement tel que décrit précédemment55,56. En bref, une lumière d'excitation de 470 nm (M470F3, Thorlabs, NJ, USA) a été modulée de manière sinusoïdale à 211 Hz à l'aide d'un programme Matlab personnalisé (MathWorks, Natick, MA, USA) et d'un dispositif d'acquisition de données multifonction (NI USB-6259, National Instruments, Austin, Texas, États-Unis). La lumière d'excitation est passée à travers un filtre d'excitation GFP (MF469-35, Thorlabs) et réfléchie par un miroir dichroïque (MD498, Thorlabs) dans un cordon de raccordement à faible fluorescence (400 µm, 0,48 NA ; lentilles doriques) via un ensemble de collimation de fibre (F240FC -A, Thorlabs). Le cordon de raccordement a été connecté à la fibre optique implantée de l'animal via un manchon en zircone (SLEEVE_ZR_2.50, Doric Lenses). La fluorescence GCaMP6f a été collectée à travers le cordon de brassage et passée à travers un filtre d'émission GFP (MF525-39, Thorlabs) et focalisée sur un photodétecteur (LA1540-A, Thorlabs; Modèle 2151, Newport, Irvine, CA, USA). Le signal a ensuite été envoyé à un amplificateur synchrone (constante de temps de 30 ms, modèle SR830, Stanford Research Systems, Sunnyvale, Californie, États-Unis) synchronisé à 211 Hz, puis collecté à 1 KHz avec un script Matlab personnalisé et un système de données multifonction. dispositif d'acquisition (National Instruments). Les signaux GCaMP6f ont été alignés sur les comportements dans la chambre opérante via des impulsions TTL envoyées depuis la chambre opérante et enregistrées dans un flux de données parallèle via un script Matlab personnalisé. Pour quantifier le changement des signaux GCaMP6f, les valeurs avant les transitions d'état ont été moyennées comme ligne de base, et la taille de la zone (intégrale ΔF/F) entre la ligne de base et la trace du signal GCaMP6f a été déterminée et moyennée pour chaque souris individuelle.

Pour examiner l'effet de la stimulation des neurones Hcrt dans la tâche Go/NoGo, des souris Hcrt-cre+ et Hcrt-cre- ont été connectées via un cordon de raccordement à fibre optique à un laser. L'intensité lumineuse a été calibrée à 10 mW à la pointe avec un posemètre (Thorlabs). Ensuite, un cordon de raccordement à fibre optique (MFP_200/240/900-0.22_3.0m_FC-MF2.5, lentilles doriques) a été connecté à l'implant en fibre de verre via un manchon en zircone (SLEEVE_ZR_2.50, lentilles doriques). Pour vérifier le placement des fibres, il a été confirmé que les animaux se réveillaient (initient un mouvement) dans les 20 s suivant la stimulation (5 s à 5 Hz, largeur d'impulsion de 10 ms, 10 mW) délivrée pendant un comportement de sommeil soutenu (plus de 30 secondes), comme indiqué ailleurs57 ,58. Étant donné que l'intégrité des tissus était compromise dans les tissus non fixés, la localisation anatomique de la canule a été vérifiée post mortem dans un groupe d'animaux distinct (voir Fig. 2 supplémentaire). Après accoutumance à l'appareil Go/NoGo avec attache fibre optique, une stimulation optogénétique avec des fréquences variables a été réalisée à différents points au cours des essais Go/NoGo (intensité lumineuse à la pointe de la fibre : 10 mW, largeur d'impulsion lumineuse : 15 ms ; 5 et 10 Hz stimulation pendant 5 s ont été réalisées). Le moment de la stimulation laser a été distribué au hasard entre 4 conditions d'essai : (1) aucune stimulation laser ; (2) stimulation laser pendant les 5 dernières s de la période PreCue ; (3) stimulation laser pendant les 5 premières secondes de la période Go Cue ; et (4) stimulation laser pendant les 5 premières secondes de la période de repère NoGo. Les paramètres de stimulation optogénétique ont été sélectionnés sur la base des validations précédemment rapportées de la stimulation optogénétique Hcrt de notre laboratoire18,56.

Pour la colocalisation de l'expression de ChR2/GCaMP et de l'immunoréactivité de l'hypocrétine, nous avons perfusé des souris par voie transcardiaque avec un tampon phosphate suivi d'un tampon de paraformaldéhyde à 4 % (pH 7,4). Les cerveaux extraits ont ensuite été postfixés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 2 h avant d'être placés dans une solution de saccharose à 30 % pour une cryoprotection pendant 48 h. Les cerveaux ont ensuite été sectionnés sur un cryostat Leica à 30 um et stockés dans un tampon phosphate jusqu'à coloration. Les tranches ont été bloquées dans une solution d'albumine de sérum bovin à 5 %/0,5 % de Triton pendant 1 heure à 36 C. Les tranches ont ensuite été incubées dans un anticorps primaire contre l'hypocrétine-A (Abcam ab6214) à une dilution de 1:250 dans 3 % de BSA/0,3 % de Triton. solution pendant une nuit à 4 ° C. Les tranches ont ensuite été lavées dans du PBS, suivies d'une incubation avec AlexaFlour594 à une dilution de 1: 1000 dans une solution à 3% de BSA / 0, 3% de TritonX100 à 36 ° C pendant 1,5 à 2 h. Les tranches ont ensuite été lavées dans du PBS, puis montées au DAPI.

Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide de GraphPad Prism 8.4.1. Les données de photométrie des fibres ont été analysées par analyse de variance à mesures répétées (RM-ANOVA) en utilisant le type de transition et le temps (avant par rapport à après la transition) comme facteurs statistiques. En raison de la taille inégale des échantillons entre les réponses aux essais, les données de photométrie des fibres de la transition Precue-to-Cue ont été analysées à l'aide d'un modèle à effets mixtes. L'effet des fréquences de stimulation optogénétique Hcrt sur le comportement a été évalué à l'aide de RM-ANOVA avec la fréquence de stimulation et le génotype comme facteurs statistiques. De même, l'effet du traitement pharmacologique sur le comportement a été analysé à l'aide de RM-ANOVA avec le génotype et le traitement comme facteurs. Les tests de comparaisons multiples de Bonferroni ont été effectués post hoc pour sonder les différences de groupe spécifiques (Données supplémentaires 1). Source de données pour les Fig. 2–4 se trouvent dans les données supplémentaires 2.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les ensembles de données générés et analysés au cours de la présente étude sont disponibles dans le Stanford Digital Repository [https://purl.stanford.edu/sf095mv6553. https://doi.org/10.25740/sf095mv6553].

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Ce travail a été financé par des subventions de Boehringer Ingelheim et NIH (R01HL150566, R01MH116470, R01MH102638) à LdLKJJ est récipiendaire d'une bourse postdoctorale NRSA (F32HD095597). SMT a été soutenu par une bourse postdoctorale Philip Wrightson.

Susan M. Tyree

Adresse actuelle : Atlantia Clinical Trials, Cork, Irlande

Kimberly J.Jennings

Adresse actuelle : Université du Texas, Austin, TX, États-Unis

Département de psychiatrie et des sciences du comportement, Stanford School of Medicine, Stanford, Californie, États-Unis

Susan M. Tyree, Kimberly J. Jennings, Oscar C. Gonzalez, Shi-bin Li et Luis de Lecea

Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Biberach, Allemagne

Janet R. Nicholson et Moritz von Heimendahl

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JRN, MvH et LdL ont conçu ce travail. SMT a effectué toutes les expériences comportementales, les enregistrements de calcium et l'optogénétique et a analysé les données. KJJ a effectué des enregistrements et des analyses de calcium. OCG et S.-BL ont vérifié l'emplacement anatomique de la canule et effectué une immunohistochimie. JRN, MvH et LdL ont supervisé les travaux. LdL a écrit le manuscrit avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance à Luis de Lecea.

JRN et MvH déclarent les intérêts concurrents suivants : Ils sont des employés à plein temps de Boehringer Ingelheim. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Karli Montague-Cardoso et George Inglis.

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Réimpressions et autorisations

Tyree, SM, Jennings, KJ, Gonzalez, OC et al. Des interventions optogénétiques et pharmacologiques relient les neurones à hypocrétine à l'impulsivité chez la souris. Commun Biol 6, 74 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04409-w

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Reçu : 26 février 2021

Accepté : 03 janvier 2023

Publié: 19 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04409-w

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