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Mar 19, 2023

Une voie excitatrice monosynaptique du tronc cérébral qui pilote les activités locomotrices et les réponses cardiovasculaires sympathiques

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 5079 (2022) Citer cet article

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L'exercice, y compris la locomotion, nécessite des ajustements cardiovasculaires autonomes appropriés pour répondre aux demandes métaboliques des muscles en contraction, mais l'architecture cérébrale fonctionnelle sous-jacente à ces ajustements reste inconnue. Ici, nous démontrons les circuits du tronc cérébral qui jouent un rôle essentiel dans le relais des signaux moteurs volontaires, c'est-à-dire la commande centrale, pour conduire les activités locomotrices et les réponses cardiovasculaires sympathiques. Les neurones locomoteurs mésencéphaliques chez le rat transmettent des signaux excitateurs centraux commandés sur la moelle ventrolatérale rostrale au moins partiellement via des processus glutamatergiques, pour activer à la fois les systèmes nerveux somatomoteur et sympathique. L'excitation optogénétique de cette voie monosynaptique provoque des réponses locomotrices et cardiovasculaires comme on le voit pendant l'exercice de course, tandis que l'inhibition de la voie supprime les activités locomotrices et l'élévation de la pression artérielle pendant la course volontaire sans affecter l'homéostasie cardiovasculaire basale. Ces résultats démontrent une voie sous-corticale importante qui transmet les signaux de commande centraux, fournissant un aperçu clé du mécanisme du circuit central requis pour le conditionnement physiologique essentiel pour maximiser la performance de l'exercice.

L'exercice, y compris la locomotion, qui fait partie du comportement fondamental chez les vertébrés, y compris les humains, s'accompagne d'ajustements cardiovasculaires autonomes qui fournissent les ressources métaboliques, telles que le carburant et l'oxygène, exigées par la contraction des muscles squelettiques et améliorent ainsi les performances physiques. La contribution d'un signal moteur descendant prédictif du cerveau antérieur au contrôle cardiovasculaire a été suggérée depuis plus d'un siècle1,2. Actuellement, ce signal prédictif a été appelé commande centrale et postulé comme une activation parallèle des systèmes moteurs somatique et autonome dans le cerveau pour augmenter simultanément l'activité musculaire ainsi que la pression artérielle et la contractilité cardiaque3. Ce concept est d'abord issu d'une étude humaine montrant que l'ampleur des réponses cardiovasculaires lors d'un exercice isométrique volontaire à tension musculaire constante était positivement corrélée à la quantité d'activation de la commande centrale qui était modifiée par les contractions réflexes dues à la vibration du tendon sur le muscle agoniste ou antagoniste4. La commande centrale est couplée à l'activation du système nerveux sympathique indépendamment de la rétroaction du mouvement, comme le montrent les augmentations des variables cardiovasculaires au cours de la locomotion fictive chez les chats décortiqués et paralysés5 et par les réponses cardiovasculaires exagérées à la contraction musculaire volontaire chez les sujets humains après la paralysie6,7.

L'emplacement précis de la source de la commande centrale reste incertain car le mécanisme du circuit central par lequel les signaux de commande centrale provoquent des ajustements cardiovasculaires autonomes pendant l'exercice n'a pas encore été complètement élucidé. Les régions cérébrales autonomes activées en réponse à l'exercice volontaire8,9,10,11,12 ou les régions dont la stimulation provoque des réponses autonomes ou somatomotrices13,14,15,16,17,18 peuvent être impliquées dans le contrôle central de la circulation. Par exemple, des études humaines utilisant des techniques neurochirurgicales ont suggéré que les circuits mésencéphaliques, y compris le noyau sous-thalamique (STN) et le gris périaqueducal (PAG), dont les activités neuronales sont élevées pendant l'exercice volontaire11, configurent les circuits sous-corticaux pour relayer les signaux de commande centraux19, comme en témoigne l'effet presseur de stimulation électrique du STN17 ou du PAG18 dorsal/latéral chez des patients éveillés atteints de la maladie de Parkinson ou de douleurs chroniques. Néanmoins, les rôles causals de ces régions du cerveau dans les changements autonomes au cours de l'exercice ainsi que les connexions fonctionnelles avec d'autres régions n'ont pas été démontrés. Le substrat cérébral du commandement central a également acquis une importance clinique. Une régulation cardiovasculaire anormale pendant l'exercice dans des conditions pathologiques, telles que l'insuffisance cardiaque, augmente l'intolérance à l'exercice et le risque d'événements cardiaques mortels tels que l'arythmie20. Ceci est au moins en partie causé par un dysfonctionnement de la commande centrale21,22, alors que les programmes d'exercices thérapeutiques pour les patients améliorent leur état fonctionnel et leurs résultats23.

La moelle ventrolatérale rostrale (RVLM), située immédiatement caudale par rapport au pôle caudal du noyau facial, contient des neurones prémoteurs sympathiques à projection spinale, dont plus de la moitié sont des neurones C1 adrénergiques24. Les neurones RVLM C1 et non-C1 sont excités par l'exercice volontaire8,9,12 et jouent un rôle central dans la régulation du tonus vasomoteur sympathique25,26,27,28. Ainsi, le RVLM est probablement un nœud clé du mécanisme du circuit central pour les réponses cardiovasculaires sympathiques pendant l'exercice29. Dans la présente étude, pour identifier une voie monosynaptique sous-corticale qui transmet des signaux de commande centraux au RVLM pendant l'exercice volontaire pour susciter des réponses cardiovasculaires, nous avons effectué des expériences de neuroanatomie fonctionnelle et physiologiques in vivo chez des rats pour enregistrer les décharges nerveuses périphériques, les changements cardiovasculaires et les comportements chez les rats. combinaison avec des techniques optogénétiques pour manipuler une voie d'intérêt.

Nous avons d'abord recherché des neurones projetant le RVLM chez le rat via un traçage rétrograde avec le traceur, la sous-unité b de la toxine cholérique (CTb), injecté unilatéralement dans le RVLM (Fig. 1a, b). Un nombre important de corps cellulaires neuronaux marqués au CTb se sont révélés être distribués bilatéralement dans les zones du mésencéphale, notamment le noyau cunéiforme (CnF) et le noyau tegmental pédonculopontin (PPTg), ce dernier abritant de nombreux neurones cholinergiques (Fig. 1c). Ces deux noyaux constituent une zone fonctionnelle connue sous le nom de région locomotrice mésencéphalique (MLR), qui est capable d'initier et de contrôler la locomotion et est bien conservée au cours de l'évolution parmi les espèces de mammifères, y compris les humains30,31. Par conséquent, nous nous sommes concentrés sur cette voie monosynaptique MLR → RVLM en tant que candidat pour la voie sous-corticale qui assure la médiation de la signalisation de commande centrale engagée pour l'exercice locomoteur. Le MLR contient des neurones glutamatergiques et GABAergiques, en plus des neurones cholinergiques PPTg, qui envoient bilatéralement de nombreuses projections à travers la formation réticulaire médullaire32. Cependant, très peu de neurones PPTg marqués au CTb étaient immunoréactifs pour la choline acétyltransférase (ChAT) (0, 6 ± 0, 3%, n = 3) (Fig. 1d). Ainsi, les neurones MLR projetant RVLM sont principalement non cholinergiques.

a, b Injection de CTb dans le RVLM unilatéralement. TH tyrosine hydroxylase; IO noyau olive inférieur ; noyau paragigantocellulaire latéral LPGi ; NA noyau anbiguus. Barre d'échelle : 1 mm. c Dessin de la distribution des cellules marquées CTb [combinées de 8 rats (6 mâles, 2 femelles)] et des cellules immunoréactives ChAT positives ou négatives CTb [combinées de 3 rats sur 8 (2 mâles et 1 femelle)] dans la coupe coronale du mésencéphale. Aqueduc d'Aq ; PAG gris périaqueducal. d Image confocale montrant que les cellules PPTg marquées au CTb n'étaient pas fusionnées avec les cellules immunoréactives au ChAT. Barre d'échelle : 50 μm. e, f Injections AAV-CMV-ChIEF-tdTomato dans le MLR bilatéralement. Barres d'échelle : 1 mm (mésencéphale) et 200 μm (agrandi). g axones marqués par tdTomato distribués dans la moelle ventrale. Barre d'échelle : 1 mm. h Image confocale montrant des associations étroites de gonflements axonaux marqués par tdTomato contenant VGLUT2 (têtes de flèches) avec la dendrite neuronale RVLM C1 et le corps cellulaire (astérisque). Barre d'échelle : 10 μm. i Schéma expérimental pour étudier les immunoréactivités Fos dans les neurones MLR projetant RVLM de rats entraînés et non entraînés sur tapis roulant. j Coloration par immunofluorescence de GFP et Fos. Les pointes de flèche indiquent l'expression de Fos dans les cellules marquées à la GFP trouvées dans le PPTg. Barres d'échelle : 100 μm. k Comparaisons de cellules Fos-immunoréactives dans des neurones MLR marqués à la GFP et projetant RVLM entre des témoins non exercés et des rats exercés (n = 7 pour chaque groupe distinct ; tous les mâles). Les données ont été analysées par le test t de Welch bilatéral ; les informations statistiques, y compris les valeurs statistiques t et les degrés de liberté, sont présentées dans le tableau supplémentaire 15. Les données présentées sont des moyennes ± SEM. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. Les images de la section du cerveau utilisées dans les figures (a, e, i) ont été adaptées de "Paxinos G & Watson C. Le cerveau de rat en coordonnées stéréotaxiques. 6e éd. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)".

Pour tracer de manière antérograde la voie MLR → RVLM, nous avons effectué des injections bilatérales dans la région à travers le CnF et le PPTg avec un vecteur de virus adéno-associé (AAV) codant pour ChIEF, une variante de la channelrhodopsine, fusionnée avec tdTomato (Fig. 1e, f). Les axones dérivés du MLR, marqués au ChiEF-tdTomato, étaient abondamment distribués dans la partie ventrale de la moelle (Fig. 1g); de plus, les gonflements axonaux dérivés du MLR qui contenaient le transporteur vésiculaire du glutamate 2 (VGLUT2) étaient étroitement associés aux corps cellulaires et aux dendrites des neurones RVLM C1 (Fig. 1h), suggérant qu'un contact synaptique existe entre les neurones glutamatergiques MLR → RVLM et les neurones RVLM C1. . Dans l'ensemble, ces observations indiquent que le RVLM reçoit des projections bilatérales monosynaptiques glutamatergiques du MLR.

Nous nous sommes ensuite demandé si la voie MLR → RVLM était activée par la course à pied. Nous avons étudié l'expression de Fos, un corrélat biochimique de déclenchement accru, dans les neurones de projection MLR → RVLM après une course volontaire chez des rats ayant reçu des injections RVLM bilatérales d'un AAV rétrograde (AAVrg) codant pour l'EGFP ; ces rats avaient été entraînés à s'habituer à l'exercice volontaire sur tapis roulant (Fig. 1i). En accord avec les observations de rats ayant reçu une injection de CTb, la transduction par AAVrg de neurones projetant RVLM a entraîné la localisation dense de corps cellulaires non cholinergiques marqués à l'EGFP dans le MLR à travers le CnF et le PPTg (Fig. 1a, b supplémentaires). La course volontaire sur le tapis roulant (16 m / min pendant 40 min) a augmenté l'expression de Fos dans les neurones MLR marqués à l'EGFP (c'est-à-dire projetant RVLM), par rapport au contrôle sans exercice (Fig. 1j, k). Ces résultats indiquent que l'exercice de course volontaire active la voie MLR → RVLM, conformément à l'idée que cette voie monosynaptique fait partie du mécanisme du circuit central qui assure la médiation de la signalisation de commande centrale volontaire engagée pour l'exercice de course.

Une expression accrue de Fos après un exercice sur tapis roulant a également été observée dans les neurones PPTg immunoréactifs à la ChAT (Fig. 1c, d supplémentaires). Les neurones PPTg cholinergiques excités peuvent jouer un rôle dans l'accélération, mais pas dans la stimulation, de la locomotion pendant l'exercice de course33.

Pour étudier le rôle des neurones MLR → RVLM dans la régulation cardiovasculaire autonome, nous avons examiné l'effet de la stimulation optogénétique des neurones MLR → RVLM sur la pression artérielle (AP) et la fréquence cardiaque (FC). Chez des rats anesthésiés à l'uréthane, dans lesquels les neurones MLR exprimaient ChIEF-tdTomato ou palGFP (témoin) via des injections d'AAV dans le MLR (Fig. 1e – h), le RVLM était illuminé bilatéralement à l'aide d'une lumière laser bleue pulsée de 5 ms (473 longueur d'onde nm) avec une sortie de 10 mW (lorsqu'il est activé en continu) pour photostimuler les axones neuronaux MLR → RVLM via des fibres optiques insérées dans le cerveau (Fig. 2a supplémentaire). Une série d'impulsions à 20 ou 40 Hz pendant 2 min a systématiquement provoqué des réponses pressives et tachycardiaques chez les rats exprimant ChIEF-tdTomato, mais pas chez les témoins exprimant palGFP (Fig. 2b, c supplémentaires). Ces observations indiquent que les neurones excités MLR → RVLM déclenchent des réponses cardiovasculaires autonomes, ce qui nous a incités à examiner directement le rôle sympathoexcitateur de la voie monosynaptique MLR → RVLM avec enregistrement électrophysiologique de l'activité du nerf sympathique rénal (RSNA).

Chez des rats anesthésiés, dans lesquels les neurones projetant le RVLM exprimaient la channelrhodopsine-2 (ChR2) marquée avec la GFP ou l'EGFP témoin via des injections bilatérales d'AAVrg dans le RVLM (Fig. 1a, b supplémentaires), le MLR était illuminé bilatéralement pour photostimuler les corps cellulaires /dendrites des neurones MLR → RVLM (ciblage somatique) de manière intermittente, c'est-à-dire via une série d'impulsions de 0,5 s (lumière laser bleue pulsée de 5 ms à 10, 20 ou 40 Hz, sortie laser de 10 mW) avec un intervalle de 1,5 s pendant 1 min ; les effets de cette procédure sur le RSNA ont ensuite été examinés (Fig. 2a). La photostimulation a provoqué une sympathoexcitation rénale (RSNA) qui était synchrone avec chaque épisode d'impulsions d'éclairage de 0, 5 s et s'est accompagnée d'une augmentation de l'AP mais pas de la FC tout au long de la période de stimulation d'une minute (Fig. 2b). La superposition et la moyenne des analyses sur les changements de RSNA sur 30 périodes d'interventions (Fig. 2c) ont montré que la série d'impulsions à 10 ou 20 Hz mais pas à 40 Hz provoquait de manière significative une sympathoexcitation rénale, qui était suivie d'une sympathoinhibition rapide et d'un retour aux niveaux de pré-photostimulation. (Fig. 2d). La composante sympathoexcitatrice en réponse à la photostimulation à 40 Hz, telle qu'évaluée par l'aire sous la courbe (AUC) pour les changements de RSNA (Fig. 2c), était 29% plus petite que celle à 20 Hz (P = 0,034, bilatéral test t apparié), peut-être en raison d'effets anesthésiques puisque la photostimulation à 40 Hz chez des rats décérébrés non anesthésiés a augmenté de manière significative le RSNA comme celui à 20 Hz (décrit plus tard; Fig. 3). L'anesthésie à l'uréthane pourrait amplifier l'effet de l'inhibition récurrente recrutée par photostimulation à haute fréquence dans le circuit sympatorégulateur. Indiquant la spécificité des réponses sympathoexcitatrices / sympatho-inhibitrices provoquées par la stimulation optogénétique des neurones MLR → RVLM, aucun changement de RSNA n'a été provoqué par l'illumination des neurones MLR exprimant l'EGFP et projetant le RVLM chez les rats témoins (Fig. 3a supplémentaire).

a Stimulation optogénétique des neurones MLR → RVLM chez des rats anesthésiés. Flèches : emplacements des extrémités des fibres optiques. b Enregistrement représentatif pendant la stimulation optogénétique (20 Hz) chez un rat anesthésié exprimant ChR2-GFP. Les fonds de couleur bleu aqua indiquent les périodes d'illumination. c Analyse de superposition et de moyenne effectuée sur RSNA illustrée dans le panneau b. Les évolutions temporelles (intervalles de 10 ms) des variations en pourcentage du RSNA par rapport à la ligne de base (= valeur moyenne de 30 s avant la première intervention optogénétique) au cours de chaque cycle (en haut) ont été moyennées à chaque instant sur 30 interventions (en bas). d Cours temporels (intervalles de 100 ms) de ∆RSNA, après superposition et analyse de la moyenne, en réponse à la stimulation intermittente des neurones MLR → RVLM chez des rats anesthésiés exprimant ChR2-GFP [n = 9 (7 mâles, 2 femelles) outre n = 7 (5 mâles, 2 femelles) à 10 Hz]. e Effet des blocages des récepteurs du glutamate dans le RVLM sur la réponse RSNA à la stimulation des neurones MLR → RVLM (20 Hz) chez des rats mâles anesthésiés exprimant ChR2-GFP (n = 6). Flèches : emplacements des embouts de pipette pour les injections RVLM. Les données ont été analysées par Friedman one-way RM ANOVA par rang (car le test de normalité ou d'égale variance n'a pas été réussi) suivi par le test post hoc de Dunnett (d) ou par un test t apparié bilatéral (e). Les informations statistiques, y compris les valeurs statistiques F/t/χ2 et les degrés de liberté, sont présentées dans le tableau supplémentaire 15. * P < 0,05 par rapport à la ligne de base moyenne de 30 s. #P < 0,05 vs 1-s valeurs moyennes immédiatement avant chaque photostimulation sur 30 interventions. Les valeurs de référence pour les panneaux d et e sont indiquées dans les tableaux supplémentaires 2 et 4, respectivement. Les données présentées sont des moyennes ± SEM. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. Les images de la section du cerveau utilisées dans les figures (a, e) ont été adaptées de "Paxinos G & Watson C. Le cerveau de rat en coordonnées stéréotaxiques. 6e éd. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)".

a Stimulation optogénétique des neurones MLR → RVLM chez des rats décérébrés non anesthésiés. b Un enregistrement représentatif pendant la stimulation optogénétique (40 Hz) chez un rat décérébré exprimant ChR2-GFP. c, d Cours temporels après analyse de superposition et de moyenne (c bacs de 100 ms) et tout au long des interventions optogénétiques (d bacs de 10 s) de ∆RSNA et ∆VRNA en réponse à une stimulation intermittente de 1 min des neurones MLR → RVLM dans ChR2 - exprimant des rats mâles décérébrés (n = 6). e Effet des blocages des récepteurs du glutamate dans le RVLM sur les réponses ∆VRNA et ∆AP à une stimulation soutenue de 15 s des neurones MLR → RVLM (40 Hz), évalués par leurs valeurs intégrées pendant 15 s, chez un homme décérébré exprimant ChR2-GFP rats (n = 6). Les données ont été analysées par ANOVA RM unidirectionnelle / ANOVA RM unidirectionnelle de Friedman par rang suivi du test post hoc de Dunnett (c, d) ou d'un test t apparié bilatéral (e). Les informations statistiques, y compris les valeurs statistiques F/t/χ2 et les degrés de liberté, sont présentées dans le tableau supplémentaire 15. * P < 0,05 par rapport à la ligne de base moyenne de 30 s. #P < 0,05 vs 1-s valeurs moyennes immédiatement avant chaque photostimulation sur 30 interventions. Les valeurs de base pour les panneaux (c, d) et (e) sont indiquées dans les tableaux supplémentaires 5 et 7, respectivement. Les données présentées sont des moyennes ± SEM. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. L'image de la section du cerveau utilisée dans la figure (a) a été adaptée de "Paxinos G & Watson C. Le cerveau de rat en coordonnées stéréotaxiques. 6e éd. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)".

Étant donné que les neurones MLR → RVLM expriment VGLUT2 dans leurs terminaisons axonales (Fig. 1h) et que de nombreux neurones RVLM expriment des récepteurs ionotropes du glutamate, nous avons examiné si la transmission glutamatergique dans le RVLM contribuait à la sympathoexcitation médiée par les neurones MLR → RVLM. La réponse RSNA à une stimulation optogénétique intermittente de 1 min (à 20 Hz) des neurones MLR → RVLM a été testée 10 à 20 min après des injections bilatérales dans le RVLM avec une solution saline (50 nL) ou un mélange d'acide 2-amino-5-phosphonovalérique et cyanquixaline (AP5/CNQX ; 10 mM dans une solution saline ; 50 nL). Comparé au traitement salin, le traitement AP5 / CNQX a entraîné une diminution de 23% de la réponse RSNA induite par optogénèse, telle qu'évaluée par les valeurs d'ASC pour les modifications du RSNA (Fig. 2e; Fig. Supplémentaire 3b). À 60 min après le traitement AP5/CNQX, la réponse RSNA a récupéré à 90 % de celle après les traitements salins (P = 0,58 ; test t apparié bilatéral). Pris ensemble, ces résultats indiquent que la transmission glutamatergique dans le RVLM contribue à la signalisation MLR → RVLM qui entraîne la sympathoexcitation rénale.

Étant donné que les neurones MLR glutamatergiques jouent un rôle important dans l'évocation de la locomotion33,35,36,37, nous nous sommes demandé si l'excitation des neurones MLR → RVLM suscite non seulement une sympathoexcitation mais également une excitation des motoneurones, à savoir l'activation de la commande centrale. Pour étudier cette possibilité, nous avons simultanément enregistré des décharges dans les fibres nerveuses efférentes sympathiques périphériques et somatomotrices chez des rats décérébrés, non anesthésiés et paralysés. Dans cette préparation, alors que la perte d'inhibition des circuits corticothalamiques conduit à une hyperactivité du tronc cérébral, il est avantageux que les effets de l'anesthésie et de la rétroaction des mouvements puissent être écartés. Les rats décérébrés, dans lesquels les neurones projetant RVLM exprimaient ChR2-GFP, ont reçu des impulsions laser vers le MLR unilatéralement de manière intermittente pendant 1 min, comme indiqué ci-dessus (sortie laser 20 mW; Fig. 3a). La stimulation optogénétique des neurones MLR → RVLM a augmenté la PA sans effets significatifs sur la fréquence cardiaque et a augmenté les décharges dans les fibres nerveuses rénales sympathiques et somatomotrices de la racine ventrale L5 (Fig. 3b). Notamment, la manière de décharger ces fibres nerveuses lors des interventions optogénétiques différait ; La sympathoexcitation rénale (RSNA) a été déclenchée immédiatement et de manière synchrone avec chaque épisode d'impulsions d'éclairage de 0, 5 s, tandis que l'activité du nerf de la racine ventrale (VRNA) a été progressivement élevée et maintenue tout au long des interventions d'une minute (Fig. 3b – d). Les augmentations soutenues de l'ARNV sont cohérentes avec celles des études précédentes, qui ont examiné l'effet de la stimulation électrique du MLR chez les rats décérébrés21 et les chats39. De telles différences dans les caractéristiques des réponses de décharge neuronale sympathique et somatomotrice suggèrent que les circuits médullospinaux entre les neurones MLR → RVLM et les motoneurones spinaux jouent un rôle de filtre passe-bas, alors que des circuits médullospinaux distincts en aval de la voie MLR → RVLM médient la voie sympathique rapide. réponses nerveuses. Contrairement à l'activation médiée par ChR2 des sorties motrices sympathiques et somatiques, l'illumination dans les témoins exprimant l'EGFP n'a provoqué aucun changement dans l'ARNV (Fig. 3c, d supplémentaires).

En utilisant des rats décérébrés, nous avons également testé si l'excitation des motoneurones et les réponses cardiovasculaires provoquées par la stimulation des neurones MLR → RVLM impliquent la neurotransmission glutamatergique dans le RVLM. Les injections bilatérales d'AP5 / CNQX dans le RVLM ont réduit de manière significative l'activation de l'ARNV et l'élévation de l'AP en réponse à une photostimulation soutenue de 15 s des neurones MLR → RVLM de 64 et 34% (évaluée via l'intégration des modifications de l'ARNV et de l'AP au cours de la stimulation de 15 s période), respectivement, par rapport à ceux après des injections de solution saline (Fig. 3e; Fig. Supplémentaire 3e). Les réponses VRNA et AP ont récupéré 60 min après le traitement AP5/CNQX de 105 et 81 % des réponses après traitement salin (P = 0,62 et 0,16 ; test t apparié bilatéral ; n = 3), respectivement. En revanche, la stimulation optogénétique n'a eu aucun effet sur la fréquence cardiaque (Fig. 3e supplémentaire). Au total, les neurones MLR → RVLM excités augmentent simultanément les tonalités vasoconstrictrices et somatomotrices sympathiques en partie via la transmission glutamatergique dans le RVLM.

L'activation par la voie MLR → RVLM des systèmes nerveux sympathique et somatomoteur nous a amenés à rechercher si la stimulation de cette voie provoque à la fois des activités locomotrices et des modifications cardiovasculaires autonomes, comme on le voit dans l'exercice de course. Les rats chez lesquels les neurones projetant RVLM ont exprimé ChR2-GFP ou contrôlent l'EGFP via des injections bilatérales d'AAVrg dans le RVLM ont subi un éclairage MLR via des fibres optiques et leur AP a été surveillé avec un télémètre de pression dans des conditions de mouvement libre. Des rats conscients ont été placés dans une piste circulaire (ID100 et OD140 cm), et lorsqu'ils se reposaient mais ne dormaient pas ou ne bougeaient pas (par exemple, se toilettant), les corps cellulaires des neurones MLR → RVLM étaient illuminés sous des enregistrements continus de AP, HR et comportements (Fig. 4a–c).

a Stimulation optogénétique des neurones MLR → RVLM chez des rats conscients laissés libres de se déplacer sur une piste circulaire. b Transduction de GFP dans les fibres axonales de la moelle d'un rat exprimant ChR2-GFP (autofluorescence). Barres d'échelle : 1 mm. c Cellules immunoréactives GFP et ChAT dans le mésencéphale. Astérisques : emplacement de la pointe de fibre optique implantée. Barres d'échelle : 1 mm. d Enregistrement représentatif pendant une intervention optogénétique soutenue de 15 s (40 Hz; 20 mW) chez un rat conscient exprimant ChR2-GFP. e L'évolution temporelle (intervalles de 3 s) change en réponse à une stimulation optogénétique soutenue de 15 s (n = 8, en plus de n = 7 pour la stimulation bilatérale, tous les hommes). Les tracés de chaque rat sont présentés dans la Fig. 4a supplémentaire. f Enregistrement représentatif au cours d'interventions optogénétiques intermittentes répétées cinq fois (laser allumé 5 s / laser 5 s éteint) (40 Hz; 20 mW) chez un rat conscient exprimant ChR2-GFP. Flèches : déconnexion des signaux de télémétrie. Cet enregistrement a été inclus dans les résultats car la déconnexion s'est produite après des interventions optogénétiques. g L'évolution temporelle (bacs de 5 s) change au cours de stimulations optogénétiques répétées cinq fois (n = 8, en plus de n = 7 pour la stimulation bilatérale). Les tracés de chaque rat sont présentés dans la Fig. 4c supplémentaire. Les données ont été analysées à l'aide de l'ANOVA RM unidirectionnelle/de l'ANOVA RM unidirectionnelle de Friedman par rang, suivie du test post hoc de Dunnett [e, g]. Les informations statistiques, y compris les valeurs statistiques F/t/χ2 et les degrés de liberté, sont présentées dans le tableau supplémentaire 15. * P < 0,05 par rapport à la ligne de base moyenne de 15 s. Les vues aériennes pendant les enregistrements présentés dans les panneaux (d) et (f) sont rapportées dans les films supplémentaires 1 et 2, respectivement. Les valeurs de base pour les panneaux (e) et (g) sont indiquées dans les tableaux supplémentaires 8 et 9, respectivement. Les données présentées sont moyennes ± SEM. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. L'image de la section du cerveau utilisée dans la figure (a) a été adaptée de "Paxinos G & Watson C. Le cerveau de rat en coordonnées stéréotaxiques. 6e éd. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)".

L'illumination unilatérale des corps cellulaires des neurones MLR → RVLM exprimant ChR2-GFP pendant 15 s avec une lumière laser bleue pulsée à 40 Hz (sortie laser de 20 mW) a immédiatement augmenté l'AP et provoqué tardivement une tachycardie. Tout au long de la période de stimulation, la photostimulation a également suscité la locomotion ou la course de tout le corps sans entraver la capacité de freiner ou de tourner (Fig. 4d, e ; Fig. 4a supplémentaire ; Film supplémentaire 1). De plus, des interventions optogénétiques unilatérales répétées cinq fois dans lesquelles un cycle consistait en un laser allumé de 5 s et un laser éteint de 5 s à 40 Hz (20 mW) ont également provoqué des réponses pressives et des réponses tachycardiaques et locomotrices ultérieures, qui ont été fidèlement synchrone avec chaque épisode d'impulsions d'éclairage de 5 s (Fig. 4f, g; Supplémentaire Fig. 4c; Supplémentaire Film 2). Les distances parcourues/courues par les rats et les réponses cardiovasculaires au cours de ces photostimulations (évaluées par intégration pendant la période de stimulation) dépendaient de la fréquence entre 10, 20 et 40 Hz (à 20 mW) et de l'intensité entre 10, 20 et 35–40 mW (à 40 Hz) (Fig. 4b, d supplémentaires). La stimulation optogénétique bilatérale a provoqué des réponses locomotrices et cardiovasculaires similaires à celles provoquées par une stimulation unilatérale (Fig. 4e, g). Cependant, l'éclairage MLR chez les témoins exprimant l'EGFP n'a pas évoqué la locomotion ou les changements cardiovasculaires (Fig. 5 supplémentaire). Ces résultats démontrent que les neurones excités MLR → RVLM pilotent à la fois les réponses locomotrices et cardiovasculaires, ce qui soutient l'idée que les signaux de commande centraux transmis par la voie MLR → RVLM jouent un rôle dans la coordination des mouvements locomoteurs des membres et des contrôles cardiovasculaires autonomes nécessaires à l'exercice de course.

La stimulation optogénétique des corps cellulaires neuronaux MLR → RVLM n'a pas provoqué de tachycardie chez les rats anesthésiés ou décérébrés (Figs. 2, 3) probablement parce que le RVLM contrôle principalement l'activité vasomotrice sympathique plutôt que les fonctions cardiaques25,26,27,28. Pendant ce temps, cette stimulation chez les rats conscients a augmenté la FC (Fig. 4). La réponse tachycardiaque pourrait être secondaire à la réponse locomotrice. L'activation du réflexe basé sur les muscles squelettiques (c'est-à-dire le réflexe presseur d'exercice) due au mouvement ou à la contraction des muscles des membres chez les rats conscients devrait être impliquée dans la réponse HR40. Il est également probable que la stimulation de la voie MLR → RVLM active par la suite d'autres circuits centraux qui à leur tour déclenchent des réponses cardiovasculaires. Par exemple, le MLR régule l'état cortical parallèlement à la locomotion41.

Nous avons également examiné si une autre voie sympathoexcitatrice projetant le RVLM médie la locomotion. Le noyau paraventriculaire hypothalamique (PVN) contient une abondance de neurones projetant RVLM, dont la stimulation sélective chez les rats anesthésiés provoque une sympathoexcitation42. Nous avons constaté que la stimulation optogénétique de la voie PVN → RVLM chez des rats conscients et se déplaçant librement augmentait l'AP mais ne provoquait jamais de locomotion (Fig. 6 supplémentaire). Ainsi, contrairement à la voie MLR → RVLM, la voie sympathoexcitatrice PVN → RVLM n'est pas impliquée dans le contrôle moteur somatique de la locomotion.

Pour examiner la nécessité des neurones MLR → RVLM dans l'intégration motrice somatique-autonome pour les activités locomotrices, nous avons testé si l'inhibition de cette voie lors d'un exercice de course volontaire atténue à la fois l'activité locomotrice et les réponses cardiovasculaires. Pour inhiber optogénétiquement les neurones MLR → RVLM, nous avons combiné le système d'expression dépendant de Cre avec des AAV antérogrades et rétrogrades pour transduire sélectivement les neurones MLR → RVLM avec un channelrhodpsin iChloC conducteur de chlorure fusionné avec mCherry ou eYFP de contrôle ; le MLR a ensuite été illuminé bilatéralement avec des impulsions laser bleues43 (Fig. 5a). iChloC-mCherry ou eYFP a été exprimé dans 79 ± 5% des neurones MLR exprimant Cre (n = 10 rats, chez lesquels l'immunocoloration Cre a réussi; Fig. 5b). Les axones marqués iChloC-mCherry / eYFP étaient abondamment distribués dans le RVLM, dans lequel les terminaisons axonales étaient opposées aux neurones RVLM C1 (Fig. 5c), suggérant des contacts synaptiques entre les neurones MLR → RVLM marqués et les neurones RVLM C1.

a Inhibition optogénétique des neurones MLR → RVLM de rats conscients libres de se déplacer dans une cage contenant une roue de soucoupe volante. b Expression iChloC-mCherry dépendante de Cre dans les neurones MLR → RVLM. Astérisque : emplacement de la pointe de la fibre optique. Barres d'échelle : 1 mm (à gauche) ; 20 μm (droite). c Distribution des axones mCherry-immunoréactifs dans la moelle (à gauche) ; les gonflements étaient étroitement opposés aux dendrites neuronales et aux corps cellulaires du RVLM C1 (astérisques ; à droite). Barres d'échelle : 1 mm (à gauche) ; 10 μm (à droite). d Vitesse locomotrice représentative et changements cardiovasculaires en réponse à l'inhibition optogénétique de 2 s pendant le fonctionnement de la roue chez un rat exprimant iChloC-mcherry. WRR, taux de rotation des roues. La vue aérienne pendant l'enregistrement est rapportée dans le film supplémentaire 3. e Le cours du temps (bacs de 200 ms) change en réponse à une intervention optogénétique de 2 s pendant la course chez les témoins exprimant eYFP (n = 4) et les rats mâles exprimant iChloC-mCherry (n = 7). Gris, données individuelles moyennées sur les essais. f Comparaisons entre les témoins (45 essais/4 rats) et les rats exprimant iChloC-mCherry (96 essais/7 rats) : ∆WRR et ΔMAP intégrés pendant 5 s après le début de l'intervention optogénétique de 2 s pendant la course. Le niveau de pré-illumination a été déterminé comme une valeur moyenne pendant la période de 2 s immédiatement avant l'illumination laser. Barres horizontales, valeurs moyennes. g Tracés de ∫ ΔMAP vs. ∫ΔWRR dans chaque essai en cours. De nombreuses parcelles de rats exprimant iChloC-mCherry réparties dans le troisième quadrant. h Comparaisons des pourcentages d'essais entre les témoins et les rats exprimant iChloC-mCherry et entre les modèles de ∫ ΔWRR et ∫ ΔMAP. i Comparaison entre les témoins (39 essais/4 rats) et les rats exprimant iChloC-mCherry (69 essais/7 rats) de ∫ ΔMAP au repos. Les données ont été analysées via ANOVA RM unidirectionnelle suivie du test post hoc de Holm – Sidak ou de l'ANOVA RM unidirectionnelle de Friedman par rang suivi du test post hoc de Dunnett (e), test t de Welch bilatéral (f), bidirectionnel RM ANOVA suivi du test de Tukey (h) ou du test U de Mann-Whitney (i). Les informations statistiques, y compris les valeurs statistiques F/t/χ2 et les degrés de liberté, sont présentées dans le tableau supplémentaire 15. *P < 0,05 par rapport au niveau de pré-illumination moyen de 2 s immédiatement avant l'intervention optogénétique (e). †P < 0,05 par rapport à tous les autres essais dans chaque groupe (h). ‡P < 0,05 par rapport aux témoins dans chaque modèle (h). Les valeurs de base pour les panneaux (e–h) et (i) (= niveau de pré-éclairage) sont indiquées dans les tableaux supplémentaires 13 et 14, respectivement. Les données présentées sont des moyennes ± SEM. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. L'image de la section du cerveau utilisée dans la figure (a) a été adaptée de "Paxinos G & Watson C. Le cerveau de rat en coordonnées stéréotaxiques. 6e éd. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)".

Des rats conscients équipés pour la manipulation optogénétique et les mesures télémétriques de l'AP ont été autorisés à se déplacer librement dans une cage en forme de cube [45 × 45 × 40 (hauteur) cm] contenant une roue horizontale de 36 cm de diamètre (Fig. 5a) . Lors d'une course spontanée sur la roue ou au repos sur le sol de la cage, le MLR était illuminé bilatéralement pendant 2 s avec un laser pulsé de 50 ms (10 mW à 10 Hz)43. Cette approche optogénétique a été confirmée pour inhiber efficacement l'excitation neuronale MLR → RVLM par coloration immunohistochimique de Fos. L'expression de Fos a été induite dans les neurones MLR → RVLM par l'activation optogénétique médiée par ChR2 de leurs corps cellulaires sous anesthésie, et cette expression de Fos induite a été supprimée par la photoactivation simultanée de iChloC dans ces neurones (Fig. 7 supplémentaire).

Chez chaque rat avec expression iChloC-mCherry- ou contrôle eYFP- dans les neurones MLR → RVLM, des expériences ont été réalisées sur 2 à 4 jours, au cours desquelles la série d'impulsions laser a été totalement administrée 9 à 17 essais pendant la course et 5 à 15 essais au repos . Les interventions optogénétiques pendant la course volontaire de la roue ont été suivies de divers modèles de changements de comportement, tels que la reprise de la course après l'arrêt / le ralentissement de la course ou la position debout sur la roue après l'arrêt de la course, parmi les essais chez chaque rat (Fig. 8a supplémentaire; Film supplémentaire 3). Cependant, la probabilité que nous ayons rencontré le comportement de "traverser" la période de 5 secondes après le début de la série d'impulsions laser de 2 secondes était de 79% (50–100%, n = 4) pour les contrôles exprimant eYFP mais seulement 14 % (0–33 %, n = 7) pour les rats exprimant iChloC-mCherry (Fig. 8b supplémentaire). En revanche, les probabilités que l'activité locomotrice soit supprimée pendant la période de 5 s étaient plus élevées pour les rats iChloC que pour les témoins (Fig. 8b supplémentaire); la course avec une pause ou un ralentissement dans la période de 5 s a été observée dans 37 % (13 à 57 %) des essais de course pour les rats iChloC, alors que ce comportement n'a été observé chez aucun témoin. "Debout sur la roue après avoir arrêté de courir" à 5 s après le début de l'impulsion laser a été observé chez 7% (0–21%) pour les témoins mais chez 24% (14–35%) pour les rats iChloC. De plus, le fait de quitter la roue pour le sol de la cage dans la période de 5 s a été observé dans 8 à 30 % des essais pour six des 7 rats iChloC alors que 3 rats témoins n'ont jamais montré ce comportement à l'exception d'un témoin qui a quitté la roue dans 29 % des cas. les essais.

En faisant la moyenne des changements du taux de rotation des roues (WRR) et des changements cardiovasculaires sur tous les essais de course pour chaque rat, nous avons constaté que l'inhibition optogénétique des neurones MLR → RVLM pendant la course des roues exerçait des effets inhibiteurs sur l'activité locomotrice et l'élévation de l'AP sans affecter la FC (Fig. 5d–f). Étant donné que les réductions du WRR et de l'AP se sont produites immédiatement après le début de l'illumination et présentaient en moyenne une cinétique d'évolution dans le temps similaire (Fig. 5e; Fig. 8c supplémentaire), la suppression de la locomotion était peu susceptible d'être une cause de la réduction de l'AP ou vice versa. Dans les témoins exprimant l'eYFP, pendant ce temps, la série d'impulsions laser donnée pendant la course n'a eu aucun effet sur le WRR ou les changements cardiovasculaires en moyenne (Fig. 5e et f, Fig. 8c supplémentaire). Enfin, dans 20 % (0 à 31 %) des essais pour les témoins, mais dans 71 % (62 à 82 %) pour les rats iChloC, des diminutions concomitantes du WRR et de l'AP après une intervention optogénétique, quels que soient les schémas comportementaux, ont été observées (Fig. 5g et h). Ces résultats indiquent que la neurotransmission MLR → RVLM médie la signalisation de commande centrale qui est engagée dans la coordination de l'activité locomotrice et des contrôles cardiovasculaires sympathiques pendant l'exercice de course.

En revanche, les séries d'impulsions laser administrées alors que les rats étaient au repos n'ont eu aucun effet sur l'AP ou la FC chez les témoins ou chez les rats exprimant iChloC-mCherry (Fig. 5i; Fig. 9 supplémentaire). Ainsi, il est peu probable que la voie monosynaptique MLR → RVLM contribue à l'homéostasie cardiovasculaire basale.

Nos analyses neuroanatomiques fonctionnelles et nos expériences physiologiques in vivo combinées à une manipulation optogénétique chez le rat ont révélé que les neurones MLR transmettent des signaux excitateurs centraux, au moins en partie glutamatergiques, au RVLM qui stimulent à la fois les sorties somatomotrices et sympathiques pendant l'exercice volontaire. La stimulation optogénétique de la voie monosynaptique MLR → RVLM a suscité des réponses cardiovasculaires locomotrices et autonomes comme on le voit dans l'exercice de course. De plus, l'inhibition sélective de la voie MLR → RVLM a supprimé l'activité locomotrice et réduit la réponse pressive lors de la course volontaire de la roue, mais n'a pas affecté l'homéostasie cardiovasculaire basale dans des conditions de repos. Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que la voie sous-corticale MLR → RVLM constitue un élément clé du mécanisme du circuit central qui relaie les signaux de commande centraux volitionnels et assure ainsi la coordination du contrôle cardiovasculaire autonome et du contrôle somatomoteur des membres, ce qui est nécessaire pour améliorer les performances de locomotion. ou un exercice de course.

Parallèlement à la voie MLR → RVLM, le RVLM reçoit également des projections du PAG, comme illustré à la Fig. 1c. Bien que le PAG semble constituer un autre circuit sous-cortical pour la commande centrale19, on ne sait pas si les neurones PAG projetant RVLM sont engagés dans la régulation autonome pendant l'exercice et cela mérite une étude plus approfondie.

Alors que les systèmes de contrôle somatomoteur et autonome ont traditionnellement été considérés comme disparates44, les comportements primitifs des vertébrés, y compris l'exercice, la locomotion, l'alimentation, le sommeil, la réaction de combat ou de fuite ou de gel et le réflexe de douleur, sont caractérisés par des actions somatomotrices et régulation autonome45,46,47. Ainsi, l'architecture cérébrale fonctionnelle sous-tend probablement la coordination fine des activités somatomotrices et autonomes pour des comportements spécifiques, mais son organisation est actuellement mal comprise. En pertinence potentielle pour ce circuit, les doubles tracés transneuronaux chez les rats ont révélé la présence de populations neuronales avec des connexions aux systèmes moteurs somatiques et sympathiques dans des régions discrètes du cerveau48,49,50. De plus, la stimulation électrique ou chimique d'une zone de l'hypothalamus ou du mésencéphale provoque simultanément des changements somatomoteurs et cardiovasculaires chez les animaux et les humains13,14,15,17,18. Les régions qui ont déjà été étudiées neuroanatomiquement ou fonctionnellement, telles que PVN50, MLR15,49, RVLM et le noyau paragigantocellulaire latéral (LPGi) dans la formation réticulaire médullaire caudale48 entre autres13,14,15,17,18,48,49,50, peuvent participent à l'intégration motrice somatique-autonomique et affectent ainsi différents comportements. Cependant, les rôles causaux de ces régions dans les comportements ainsi que la connectivité cérébrale sous-jacente à ces rôles n'ont pas été explorés. Dans la présente étude, nous avons identifié la voie MLR → RVLM comme un mécanisme central sous-jacent à l'intégration motrice somatique-autonomique pour l'exercice de course volontaire. Par conséquent, notre étude fournit un aperçu clé de l'architecture cérébrale pour le conditionnement physiologique nécessaire pour maximiser les performances physiques.

La voie MLR → RVLM semble constituer une connexion clé par laquelle les signaux de commande centraux volontaires pour la locomotion ou l'exercice de course volontaire affectent les systèmes nerveux somatomoteur et sympathique. Comme en témoignent les différents modèles de décharges nerveuses somatomotrices et sympathiques évoquées par la stimulation des neurones MLR → RVLM (Fig. 3b – d), les signaux excitateurs de cette voie semblent conduire des voies médullospinales distinctes se connectant aux motoneurones spinaux et aux neurones préganglionnaires sympathiques. Cependant, l'organisation intrinsèque pour lier fonctionnellement la voie MLR → RVLM avec des activités locomotrices ou des réponses cardiovasculaires sympathiques n'est pas claire. Néanmoins, notre étude de traçage indique que les neurones postsynaptiques ciblés par la voie glutamatergique MLR → RVLM incluent les neurones RVLM C1 (Figs. 1h et 5c), bien que les neurones RVLM non-C1 puissent également être une cible de cette voie. Les neurones C1 et non C1 du RVLM envoient des projections axonales aux neurones préganglionnaires sympathiques de la moelle épinière24. Les signaux de commande centraux via la voie MLR → RVLM augmentent probablement les flux vasomoteurs sympathiques via ces neurones RVLM prémoteurs sympathiques.

En ce qui concerne la connectivité postsynaptique des neurones MLR → RVLM pour la régulation du système nerveux somatomoteur, nous notons que la locomotion ne peut pas être initiée par une stimulation non sélective des neurones RVLM chez les rongeurs conscients51,52, et ce point de vue est également étayé par l'absence d'effet de sympathoexcitaotry PVN → RVLM stimulation neuronale sur le comportement du rat (Fig. 6 supplémentaire). Ainsi, la locomotion pilotée par les neurones MLR → RVLM semble nécessiter l'activation d'une sous-population spécialisée de neurones RVLM, qui est spécifiquement contrôlée par cette voie monosynaptique et engage les circuits locomoteurs médullospinaux exécutifs. Les intermédiaires clés entre les neurones MLR → RVLM et les neurones locomoteurs spinaux peuvent inclure les neurones LPGi glutamatergiques. Capelli et al.35 ont montré que l'ablation conditionnelle de cette population neuronale supprimait la locomotion induite par les neurones MLR glutamatergiques chez les souris transgéniques VGLUT2-Cre, suggérant que les neurones LPGi glutamatergiques jouent un rôle modulateur dans le réglage positif de la locomotion médiée par les neurones MLR glutamatergiques. Le RVLM étudié dans nos expériences est positionné en permanence caudolatéralement au LPGi étudié par Capelli et al. couché rostro-caudal au bord caudal du noyau facial selon les données morphologiques dans le précédent35 et nos études (basées sur la distribution des neurones C1 et les zones cérébrales pour la transduction AAV/l'implantation de la canule optique), ainsi que le cerveau standard de souris et de rat atlas. Comme le RVLM et le LPGi font tous deux partie de la formation réticulaire médullaire, qui se caractérise par la structure interconnectée et le vaste réseau de voies, les neurones MLR → RVLM peuvent avoir des contacts synaptiques avec une population neuronale RVLM spécifique qui régule les neurones LPGi glutamatergiques et/ou d'autres neurones locomoteurs médullospinaux. Il est également possible que les neurones LPGi contrôlant la locomotion soient entremêlés dans la partie médiale du RVLM; ils peuvent être contrôlés post-synaptiquement par les neurones MLR → RVLM. Dans l'ensemble, alors que les signaux de commande centraux descendant par les neurones MLR → RVLM régulent le système nerveux sympathique via l'activation des neurones RVLM sympatorégulateurs, les signaux peuvent stimuler collatéralement une autre population neuronale RVLM, qui à son tour active un réseau de circuits médullospinal distinct comprenant le LPGi pour la locomotion. Des investigations supplémentaires sont nécessaires pour déterminer avec précision les mécanismes de circuit en aval séparés des neurones MLR → RVLM pour les activités locomotrices et les réponses cardiovasculaires sympathiques.

La locomotion est un représentant de divers comportements volontaires, y compris l'évasion, la poursuite et l'exploration, qui sont suscités par différentes volitions motrices. Il n'est pas certain que la voie MLR → RVLM, qui joue un rôle essentiel dans l'exercice de course volontaire, soit également engagée dans d'autres comportements locomoteurs. Néanmoins, l'activation du MLR contribue certainement à la locomotion pour l'évasion53 et la poursuite54. Caggiano et al.36 ont également suggéré que les neurones glutamatergiques CnF qui reçoivent des projections du gris périaqueducal soutiennent la locomotion rapide nécessaire à l'évasion, tandis que les neurones glutamatergiques PPTg, qui reçoivent des projections des ganglions de la base, peuvent être nécessaires pour une locomotion exploratoire lente. Ainsi, la voie MLR → RVLM peut constituer un nœud clé commun qui sous-tend le couplage somatomoteur-autonome pour ces types de comportement locomoteur, même si elle peut recevoir des entrées afférentes de circuits distincts entraînés par différentes volitions motrices. Bien que les preuves manquent actuellement, les circuits en amont qui influencent l'activité des neurones MLR → RVLM pour l'exercice de course volontaire peuvent inclure des régions cérébrales liées à la motivation interne, telles que le système hypothalamique orexinergique55 et/ou le noyau accumbens56, qui ont tous deux des projections axonales vers le MLR33,57. De plus, bien que la stimulation de l'aire motrice supplémentaire, de l'aire prémotrice ou du cortex moteur provoque une contraction musculaire couplée à une sympathoexcitation chez les sujets humains16, aucune information n'est disponible pour que les connexions cortico-sous-corticales transmettent des signaux de commande centraux. De plus, alors que la commande centrale est supposée provenir du télencéphale en tant qu'"irradiation corticale"2, il n'y a pas de consensus sur le site qui sert d'origine aux signaux de commande centrale58. Les circuits en amont qui relaient les signaux de commande centraux vers les neurones MLR → RVLM méritent une enquête plus approfondie sur les mécanismes cérébraux sous-jacents aux ajustements cardiovasculaires autonomes pendant l'exercice volontaire, un problème en suspens depuis plus d'un siècle1,2 (Fig. 10 supplémentaire).

Toutes les procédures ont été approuvées par le comité de protection des animaux (réf. : 15-Y-40, 18-Y-11, 19-Y-53) et le comité de sécurité des expériences de recombinaison génique (réf. : 28-034, 31-067, 32-061) de l'Université de Tottori. Les rats Sprague Dawley (Slc : SD ; mâle et femelle) du Japon SLC, Inc ont été utilisés dans cette étude ; ils ont été achetés auprès de Shimizu Laboratory Supplier Co, Ltd et élevés dans nos installations. Tous les rats ont été maintenus dans une pièce climatisée à 25°C avec un cycle lumière/obscurité de 12h12. Ils ont été logés dans des cages standard, à l'exception des rats pour les expériences visant à étudier l'effet de l'inhibition optogénétique via l'activation iChloC, qui ont été logés (après sevrage) dans des cages contenant une roue de soucoupe volante (36 cm de diamètre ; Exotic Nutrition). De la nourriture et de l'eau ont été mises à disposition ad libitum. Toutes les expériences in vivo ont été réalisées dans le laboratoire climatisé à 25°C.

Les AAV pour la transduction antérograde des neurones MLR avec ChIEF-tdTomato (AAV2/1-CMV-ChIEF-tdTomato) et avec palGFP (AAV2/1-CMV-palGFP) sous un promoteur CMV (la cassette génétique codant pour ChIEF-tdTomato a été donnée par R McQuiston : Addgene#32846) et pour la transduction Cre-dépendante des neurones MLR → RVLM avec iChloC-mCherry (AAV2/5-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry) (la cassette du gène codant pour iChloC-mCherry a été donnée par P. Hegemann : Addgene #85467) ont déjà été décrites43,59,60. La production et la purification de ces AAV ont suivi le protocole modifié Gene Transfer Targeting and Therapeutics Core du Salk Institute (http://vectorcore.salk.edu/protocols.php). Les plasmides requis ont été transfectés dans des cellules HEK293T et l'AAV a été purifié à partir d'un lysat brut des cellules à l'aide d'OptiPrep (Axis-Shield). Après concentration via un filtre à membrane (Amicon Ultra-15 NMWL 50 K, Merck), les titrages finaux étaient de 2,1 × 1011 GC/mL (AAV2/1-CMV-ChIEF-tdTomato), 3,5 × 1011 GC/mL (AAV2/1 -CMV-palGFP) et 3,4 × 1012 GC/mL (AAV2/5-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry). Tous les autres AAV ont été obtenus auprès d'Addgene (AAVrg-hsyn-EGFP, offert par B. Roth : Addgene#50465, 7,4 × 1012 GC/mL ; AAVrg-Syn-ChR2(H134R)-GFP, offert par E. Boyden : Addgene# 58800, 8,0 × 1012 GC/mL ; AAVrg-pgk-Cre, don de P. Aebischer : Addgene#24593, 9,5 × 1012 GC/mL ; AAV ; AAV2-Ef1a-DIO-EYFP, don de K. Deisseroth : Addgene# 27056, 3,0 × 1012 GC/mL ; AAV5-EF1a-DIO-ChR2-eYFP, don de K. Deisseroth : Addgene#35509, 1,0 × 1012 GC/mL). Les plasmides et les AAV avec les numéros Addgene fournis ici ont été obtenus dans le cadre d'accords de transfert de matériel avec Addgene.

Des rats (> 6 semaines) anesthésiés avec 1 à 5 % d'isoflurane dans de l'oxygène, intubés et ventilés artificiellement (SN480–7, Shinano) ont été placés dans une unité de tête stéréotaxique (900LOS de David Kopf Instruments, Inc., ou SR-6R de Narishige). CTb ou une solution AAV donnée a été injectée dans le site cérébral d'intérêt en utilisant un système de microinjection à pression calibrée (Nanoject II, Drummond Scientific Co.). Pour les injections au RVLM, la surface dorsale de la moelle a été exposée par une incision médiane pratiquée à travers la peau recouvrant l'arrière de la tête, suivie d'une dissection des muscles recouvrant la base du crâne, puis d'une incision pratiquée à travers l'atlanto -membrane occipitale. Les coordonnées des injections RVLM (1,0 mm rostrale et 1,8 mm latéralement au calamus scriptorius; 3,5–3,7 mm ventrale à la surface dorsale de la moelle) correspondaient à celles situées approximativement caudalement au pôle caudal des noyaux faciaux. Pour les injections au MLR (8,0 mm caudal, 2,0 mm latéral et 6,3–6,9 mm ventral au bregma), le crâne a été exposé par une incision médiane de la peau et deux trous de fraisage ont été pratiqués dans le crâne. Les solutions injectées dans le cerveau étaient les suivantes : CTb conjugué à Alexa-555 (1,0 mg/1 mL PBS, C34776, Thermo Fisher Scientific) (23,0 nL × 4, RVLM), AAV-CMV-ChIEF-tdTomato (46,0 nL × 4, MLR), AAV-CMV-palGFP (46,0 nL × 4, MLR), AAV-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry (46,0 nL × 4, MLR), AAV-Ef1α-DIO-EYFP (46,0 nL × 4, MLR), AAV-Ef1α-DIO-ChR2-eYFP (46,0 nL × 4, MLR), un mélange de AAV-Ef1α-DIO-ChR2-eYFP et AAV-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry (1:1, 46,0 nL × 4, MLR), AAVrg-hsyn-EGFP (23,0 nL × 3, RVLM), AAVrg-Syn-ChR2(H134R)-GFP (23,0 nL x 3, RVLM) et AAVrg-pgk-Cre (23,0 nL × 3 , RVLM). Après les injections, la micropipette est restée insérée pendant 5 min avant d'être retirée.

Chez les rats ayant reçu une injection de CTb, une période de récupération de 7 à 11 jours a été autorisée jusqu'à ce qu'ils soient soumis à une perfusion transcardiaque. Les rats ayant reçu une injection d'AAV utilisés dans des expériences pour examiner l'expression de Fos dans les neurones projetant RVLM ont bénéficié d'une période de récupération de 7 jours avant le début du programme d'entraînement sur tapis roulant. Chez les rats injectés d'AAV utilisés pour des expériences d'optogénétique dans des états anesthésiés ou décérébrés, une période d'au moins 14 jours a été autorisée avant les expériences. Procédures d'injection d'AAV pour des rats dans des expériences conscientes suivies d'une intervention chirurgicale supplémentaire pour implanter par voie intracrânienne des canules à fibre optique (diamètre de noyau de 200 μm, CFML52U-20, Thorlab). Deux fibres optiques pour l'éclairage bilatéral du MLR ont été insérées verticalement dans le cerveau (caudale de 8,0 mm, latérale de 2,0 mm et ventrale de 5,5 à 5,8 mm au bregma) à travers deux trous de fraisage pratiqués dans le crâne et fixées avec les vis placées entourant les trous à l'aide de ciment dentaire. Pour l'éclairage unilatéral du PVN, une fibre a également été insérée verticalement (caudale de 1, 9 mm, latérale de 0, 3 mm et ventrale de 7, 9 à 8, 2 mm au bregma) et fixée. Les rats utilisés dans des expériences conscientes ont été autorisés plus de 7 jours avant d'être soumis à une autre intervention chirurgicale pour implanter un télémètre de pression sans fil pour les mesures AP (TRM54P, Millar, Inc./Kaha Sciences), qui est décrit ci-dessous.

Chez des rats anesthésiés à l'isoflurane, intubés et ventilés mécaniquement, une incision abdominale médiane a été pratiquée pour exposer la cavité péritonéale, puis une dissection mousse a été pratiquée pour atteindre l'aorte descendante. Au cours de l'occlusion temporale de l'aorte avec une soie 2-0 à la bifurcation iliaque et en dessous de la bifurcation de l'artère rénale gauche, le capteur de pression du télémètre a ensuite été inséré dans l'aorte, avancé de 1 à 2 cm rostralement et fixé avec un filet chirurgical et colle chirurgicale biocompatible. Après la libération de l'occlusion de l'aorte, l'incision cutanée a été fermée par suture. Des expériences chez des rats conscients ont été menées au moins 1 semaine après l'implantation du télémètre.

Pour étudier immunohistochimiquement les excitabilités de la voie MLR → RVLM par un exercice de course volontaire, des rats mâles, qui avaient reçu des injections bilatérales au RVLM avec AAVrg-hsyn-EGFP, ont été entraînés sur tapis roulant 3 à 4 fois par semaine et pour un total de 14–18 jours. Le premier jour de formation, les rats ont été placés sur un tapis roulant construit sur mesure avec une grille de choc électrique installée à l'arrière (MK-680C ; Muromachi) pendant au moins 30 min. Ils ont ensuite été soumis à un exercice de course sur tapis roulant à 10 m/min et une inclinaison de 0˚ pendant 1 min, qui a été immédiatement suivi d'une période de 30 s de sonnerie (1 Hz) comme déclencheur du début de l'exercice. Cette session a été répétée 3 à 5 fois pour que les rats apprennent l'association entre le son du buzzer et le début de l'exercice. Après le deuxième jour d'entraînement, les rats avaient été soumis à une séance de course par jour. La vitesse et la durée de la course ont été progressivement augmentées sur 10 jours jusqu'à 20 m/min et 40 min, respectivement. Après avoir terminé l'exercice sur tapis roulant à 20 m/min pendant 40 min une fois, les rats ont été soumis à un exercice de course sur tapis roulant à 16 m/min pendant 40 min pour les séances d'entraînement restantes. Si le rythme de course tombait en dessous du rythme du tapis roulant au cours de chaque séance d'entraînement, une stimulation électrique légère mais aversive du pied serait fournie aux rats avec la grille de choc. Cependant, les rats ont reçu très peu de chocs car ils ont reçu un léger coup de coton-tige au moment où ils étaient sur le point de toucher la grille. Par conséquent, ces rats ont terminé le programme d'entraînement et sont devenus capables de courir volontairement sur un tapis roulant à 16 m/min pendant 40 min sans recevoir de chocs ou de coups de coude. Une période de deux jours sans entraînement était autorisée entre le dernier jour d'entraînement et le jour du protocole.

Le jour du protocole, les rats ont été choisis au hasard comme groupe "Exercice" et "Contrôle". Les rats d'exercice ont été amenés au tapis roulant, sur lequel des chocs au pied n'avaient jamais été administrés, et ont maintenu une période de repos de 15 minutes. Par la suite, après la période de 30 s du buzzer, ils ont été soumis à un exercice sur tapis roulant de 40 minutes à 16 m/min. Les coups de coude n'étaient pas nécessaires pendant cet exercice sur tapis roulant puisque les rats couraient tout au long de la période sans s'approcher de l'arrière du tapis roulant. Les rats témoins non exercés ont été amenés au tapis roulant mais non soumis à l'exercice. Quatre-vingt-dix minutes après le décalage de l'exercice ou la période de contrôle, les rats ont été profondément anesthésiés par inhalation d'isoflurane à 5 % dans de l'oxygène, puis immédiatement perfusés par voie transcardiaque (comme décrit plus loin).

Pour les interventions chirurgicales visant à mesurer les activités nerveuses périphériques et les paramètres cardiovasculaires, le rat a été anesthésié avec 1 à 5 % d'isoflurane dans de l'oxygène, intubé et ventilé mécaniquement. L'artère et la veine fémorales droites ont été cathétérisées pour mesurer la PA via un transducteur de pression (P23XL, Becton, Dickinson & Co.) et pour infuser des médicaments, respectivement. Deux électrodes à aiguille ont été placées sur les membres antérieurs pour enregistrer l'ECG à partir duquel la FC a été calculée en utilisant le temps entre les ondes R successives. Le rat a été placé dans l'unité de tête stéréotaxique. Pour mesurer le RSNA, le rein gauche a été exposé par voie rétropéritonéale à travers une incision du flanc gauche, puis un faisceau de fibres nerveuses rénales a été connecté à une électrode bipolaire en fil d'acier inoxydable. Pour mesurer l'ARNV L5, une laminectomie pour exposer la partie lombaire inférieure de la moelle épinière et une incision des couches méningées entourant la moelle ont été réalisées. Le faisceau nerveux obtenu à partir de la racine ventrale L5 gauche a été soigneusement isolé et placé sur une électrode bipolaire isolée en acier inoxydable, puis le faisceau distal à l'électrode a été coupé et ligaturé. Les décharges de la racine ventrale L5 reflètent les activités des motoneurones dirigés vers le muscle squelettique des membres postérieurs61 puisque les racines ventrales caudales à L3 chez les rats ne portent pas d'axones de neurones préganglionnaires sympathiques38. Les signaux RSNA et VRNA ont été amplifiés à l'aide d'un amplificateur AC (MEG-5200; Nihon-Kohden) avec un filtre passe-bande basse fréquence de 150 Hz et un filtre haute fréquence de 1 kHz afin qu'ils soient audibles. Les tissus nerveux exposés ont été immergés dans de l'huile minérale.

Les rats des expériences sous anesthésie ont reçu une administration intraveineuse d'uréthane (600 mg/kg) et d'α-chloralose (60 mg/kg). Chez les rats pour des expériences dans des conditions décérébrées non anesthésiées, les artères carotides bilatérales ont été ligaturées pour minimiser l'hémorragie cérébrale pendant la procédure de décérébration. Après une craniotomie pariétale, le cerveau a été sectionné coronairement avec une lame au niveau précolliculaire. Tout le tissu neural rostral à la coupe et les tissus corticaux recouvrant le cervelet ont été aspirés.

Pour délivrer la lumière laser dans la région ciblée, des canules à fibre optique, qui étaient connectées à un laser à semi-conducteurs pompé par diode de 473 nm de longueur d'onde (BL473T8-200 ; Shanghai Laser and Optic, Co.) contrôlé par un générateur d'impulsions ( SEN-7103 ; Nihon Kohden ou STOmk-2 ; BRC Co.) via un cordon de raccordement à fibre optique mono ou ramifié ont été insérés dans le cerveau. Avant l'insertion, l'intensité de sortie du laser à l'extrémité de chaque canule a été mesurée avec un appareil de mesure (LPM-100 ; BRC Co.). Pour un éclairage RVLM bilatéral, deux canules ont été insérées dans le tronc cérébral à un angle vertical par rapport à la surface dorsale du tronc cérébral (1,0 mm rostral et 1,8 mm latéral au calamus scriptorius) avec des pointes de canule situées à 3,0–3,2 mm rostroventral de la surface. Pour l'illumination de la MLR, les pointes des canules ont été insérées perpendiculairement dans le cerveau (8,0 mm caudal, 2,0 mm latéral et 5,5-5,8 mm ventral au bregma chez des rats anesthésiés non décérébrés ; 0,2-0,5 mm rostral et 2,0 mm latéralement au bord des colliculi inférieur et supérieur, et à 3,5 mm ventrale de la surface dorsale des colliculi chez les rats décérébrés). Une fois toutes les interventions chirurgicales terminées, le rat a été retiré de l'isoflurane. Au moins 60 minutes ont été laissées s'écouler avant le début des protocoles expérimentaux.

Chez des rats anesthésiés à l'uréthane respirant spontanément, qui avaient reçu des injections bilatérales au MLR avec AAV-CMV-ChIEF-tdTomato ou AAV-CMV-palGFP, le RVLM a été illuminé bilatéralement au laser à 20 ou 40 Hz avec des impulsions de 5 ms pour 30 s. La puissance du laser a été préréglée à 10 mW lorsqu'il est éclairé en continu. Chez des rats anesthésiés à l'uréthane ou décérébrés non anesthésiés qui avaient reçu des injections bilatérales dans le RVLM d'AAVrg-Syn-ChR2(H134R)-GFP ou d'AAVrg-hsyn-EGFP, 1 min intermittent (éclairage pulsé de 0,5 s avec un intervalle de 1,5 s ; 30 épisodes) ou une photostimulation soutenue de 15 s du MLR à 10, 20 ou 40 Hz avec une impulsion laser de 5 ms (puissance laser de 10 mW chez les rats anesthésiés et 20 mW chez les rats décérébrés) a été donnée. Les rats décérébrés ont été préalablement paralysés par une perfusion intraveineuse de bromure de pancuronium (0,5 mg/kg de poids corporel). Lors de la collecte des données, la fréquence de la ventilation mécanique a été fixée à 70 respirations/min, ce qui n'était pas synchronisé avec celle de la photostimulation périodique (0,5 s laser allumé et 1,5 s laser éteint). Ceci a été réalisé pour randomiser l'effet possible de l'écoulement sympathique entraîné par l'inflation pulmonaire sur les réponses RSNA à la photostimulation périodique21,61. L'ordre de fréquence de stimulation était aléatoire et des intervalles d'au moins 10 min étaient autorisés entre les manœuvres.

Un mélange d'antagonistes ionotropes des récepteurs du glutamate, l'acide 2-amino-5-phosphonopentanoïque (AP5 ; A5282 ; Merck) et la 6-cyano-7-nitro-quinoxaline-2,3-dione hydrosoluble (CNQX ; ab120044 ; Abcam) (10 mM chacun dans une solution saline) a été injecté bilatéralement dans le RVLM pour inhiber la transmission glutamatergique dans le RVLM. Les injections ont été faites avec le système de microinjection NANOJECT II par voie transcrânienne via des trous de fraisage pratiqués dans le crâne (caudal de 12,5 mm, latéral de 1,8 mm et ventral de 10,5 à 10,8 mm par rapport au bregma) ou à travers la surface dorsale de la moelle comme indiqué ci-dessus. Après les injections bilatérales de solution saline ou d'AP5/CNQX (46,0 nl/site), la durée de la photostimulation était de 5 à 20 min.

Une fois la collecte de données terminée, les canules à fibre optique et/ou les micropipettes ont été insérées et retirées à plusieurs reprises dans le cerveau pour faire des cicatrices pour la confirmation post hoc des emplacements des pointes. Le nerf rénal et le faisceau de racines ventrales ont été coupés entre l'électrode et l'axe neural pour mesurer le bruit de fond du RSNA et du VRNA, respectivement. Les rats ont été profondément anesthésiés avec une perfusion intraveineuse supplémentaire d'uréthane et d'α-chloralose ou une inhalation d'isoflurane à 5 % dans de l'oxygène, après quoi ils ont subi une perfusion transcardiale comme décrit plus loin.

Des rats mâles qui avaient reçu des injections bilatérales au RVLM avec AAVrg-hsyn-EGFP ou AAVrg-hsyn-ChR2-GFP et qui avaient été implantés avec des canules à fibre optique ainsi qu'un émetteur de télémétrie ont été soumis à des expériences pour observer les changements dans AP, HR ( calculé à partir des ondes AP), et le comportement dans un état conscient lorsque le MLR ou le PVN était éclairé au laser via les canules. Avant la journée expérimentale, les rats ont été autorisés à se déplacer librement pendant 1 à 1,5 h sur une piste circulaire et à s'habituer à l'environnement expérimental. Les diamètres intérieur et extérieur de la piste étaient de 100 et 140 cm, tandis que les hauteurs des parois intérieure et extérieure étaient respectivement de 30 et 40 cm. La paroi intérieure était en polyéthylène noir enveloppé de chlorure de polyvinyle, tandis que la paroi extérieure était en panneau acrylique transparent. Le sol de la piste était constitué de feuilles de caoutchouc à surface lisse, vert foncé ou noir.

Le jour de l'expérience, les canules à fibre optique pour l'éclairage MLR ont été connectées à un laser à semi-conducteurs pompé par diode de longueur d'onde de 473 nm via un cordon de raccordement à fibre optique mono ou ramifié de 1,5 m, 1 × 1 fibre optique rotatif joint et cordon de brassage FC-FC. La puissance de sortie du laser pour l'éclairage MLR a été préalablement ajustée avec d'autres canules à fibre optique qui avaient la même efficacité de transmission laser que celle des canules implantées. Le rat conscient a été laissé libre de se déplacer dans la piste circulaire et au moins 30 minutes ont été autorisées avant le début des expériences. Chez le rat au repos (ne dormant pas ou ne bougeant pas activement comme la marche ou le toilettage), le MLR a été éclairé unilatéralement ou bilatéralement avec des impulsions laser de 5 ms à 10, 20 ou 40 Hz après avoir recueilli les données de base pendant 15 s. Des impulsions lumineuses ont été données de manière soutenue pendant 15 s, ou par intermittence de manière répétitive cinq fois pour un laser de 5 s avec un intervalle de 5 s. Chez d'autres rats utilisés pour étudier l'effet de l'excitation neuronale PVN → RVLM, le PVN a également été éclairé au laser unilatéralement. Dans tous les cas où la déconnexion des signaux de télémétrie s'est produite pendant les interventions optogénétiques pendant plus de 1 s, les données ont été rejetées. En cas de déconnexion pendant > 1 s après des interventions optogénétiques (par exemple, Fig. 4f), les données ont été incluses dans les analyses. Chez chaque rat un jour expérimental, 2 à 6 essais ont été menés dans un ordre aléatoire et des intervalles d'au moins 10 minutes ont été autorisés entre les essais. Les jours expérimentaux étaient espacés d'au moins 2 jours.

Rats mâles ou femelles anesthésiés à l'isoflurane ayant reçu des injections bilatérales au RVLM avec AAVrg-hsyn-EGFP et au MLR avec AAV-Ef1a-DIO-eYFP, AAV-Ef1a-DIO-ChR2-eYFP, ou un mélange d'AAV- Ef1a-DIO-ChR2-eYFP et AAV-Ef1a-DIO-iChloC-mcherry ont été ventilés mécaniquement et canulés via une veine fémorale. Les pointes de fibre optique ont été insérées dans le cerveau pour un éclairage MLR (ventral de 4,5 mm au bregma). Par la suite, sous anesthésie avec perfusion intraveineuse d'uréthane et d'α-chloralose, le MLR a été illuminé bilatéralement et par intermittence (10 s allumé/10 s éteint, 90 fois) pendant 30 min avec un laser bleu pulsé de 50 ms (10 mW, 10 Hz). Quarante-cinq minutes après le décalage de l'illumination, les animaux ont été perfusés par voie transcardiaque avec du paraformaldéhyde à 4 %, puis le cerveau a été prélevé pour une coloration immunohistochimique afin de marquer l'expression de Fos comme décrit ci-dessous.

Des rats mâles juvéniles (âgés de 4 à 6 semaines) ont été logés en groupe dans des cages en verre acrylique contenant une roue de soucoupe volante de 36 cm de diamètre (Exotic Nutrition). Par conséquent, ils sont devenus disposés à courir spontanément sur la roue lorsqu'ils ont été soumis à l'étude. Après avoir atteint la maturité (> 9 semaines), ces rats ont reçu des injections bilatérales dans le MLR avec AAV-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry ou AAV-Ef1a-DIO-EYFP et dans le RVLM avec AAVrg-pgk-Cre, et ils ont été implanté avec des canules à fibre optique et un émetteur de télémétrie (comme décrit ci-dessus). L'expérience a été menée pendant la phase d'obscurité. Le jour de l'expérience, les canules à fibre optique ont été connectées au laser via les cordons de raccordement et le joint rotatif, et la puissance de sortie pour l'éclairage MLR a été préréglée à 10 mW.

Après que le rat conscient ait été laissé errer librement dans une cage en forme de cube en verre acrylique [45 × 45 × 40 (hauteur) cm] qui contenait la roue de la soucoupe volante, une période d'au moins 30 minutes a été autorisée à s'écouler avant les expériences ont commencé. Quatre petites protubérances ont été installées dans le bord de la roue à intervalles réguliers ; ceux-ci étaient faiblement en contact avec une barre placée dans la cage et connectée à un transducteur de force (FT03; Grass Instruments) via un ressort. Par conséquent, le taux de rotation de la roue (WRR) était calculable avec des intervalles de temps entre les événements de développement de tension dus aux contacts entre les protubérances et la barre. Alors que le rat courait volontairement sur la roue ou au repos (ne dormant pas ou ne bougeant pas, par exemple, se toilettant) sur le sol, le MLR était éclairé bilatéralement pendant 2 s avec des impulsions de 50 ms à 10 Hz43. L'illumination pendant la course a commencé au moins 2 s après le début de la course spontanée. En une journée, 5 à 13 essais au repos ou pendant la course ont été menés au hasard pour chaque rat avec des intervalles d'au moins 5 minutes autorisés entre les essais. Les jours expérimentaux pour chaque rat étaient espacés d'au moins deux jours.

Des rats profondément anesthésiés avec une perfusion intraveineuse supplémentaire d'uréthane ou une inhalation d'isoflurane à 5 % dans de l'oxygène ont été perfusés par voie transcardiaque avec une solution saline héparinée suivie de 4 % de paraformaldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate 0,1 M (PBS ; pH 7,4). Les cerveaux ont été prélevés, post-fixés dans le même fixateur à 4 °C pendant 2 h, puis transférés dans une solution de saccharose à 30 % à 4 °C pendant 24 à 48 h. À l'aide d'un cryostat (CM1900, Leica, Wetzlar, Allemagne ou HM505 E, GMI, Ramsey, MN, États-Unis), des coupes cérébrales coronales ou sagittales de 30 μm d'épaisseur ont été produites.

Pour la coloration par immunofluorescence, les coupes de tissus ont été lavées dans du PBS (2 lavages × 10 min) et incubées dans une solution d'anticorps (PBS contenant 0,3 % de Triton X-100, 2,5 g/L de carraghénane lambda, 200 mg/L de NaN3, 10 mL/ L sérum d'âne normal) pendant 2 h à température ambiante. Les sections ont ensuite été incubées dans une solution d'anticorps primaire pendant une nuit à 4°C. Le lendemain, après avoir rincé les coupes dans du PBS contenant 0,03 % de Triton X-100 (2 × 10 min), elles ont été incubées dans la solution d'anticorps secondaire dans l'obscurité pendant 1 h à température ambiante, puis rincées à nouveau dans du PBS ( 2 × 10 min) dans l'obscurité. Enfin, les coupes ont été montées sur des lames et recouvertes d'un liquide de montage (P36930 ; Thermo Fisher Scientific). Les images numériques des sections colorées ont été capturées avec un microscope numérique (BZ-9000 ou BZ-X710 ; Keyence) ou un microscope confocal (LSM780 ; Carl Zeiss).

Les principaux anticorps utilisés étaient les suivants : poulet anti-tyrosine hydroxylase (1:500 ; ab76442, Abcam), chèvre anti-choline acétyltransférase (1 :100 ou 1 :200 ; AB144P, Merck), chèvre anti-GFP (1 :1000 ; GTX26673, GeneTex, Irvine, CA, USA), chèvre anti-tdTomato (1:500 ; AB8181, Sicgen), souris anti-Cre Recombinase (1:1000 ; MAB3120, Merck), lapin anti-c-Fos (1 : 400; 2250s, Cell Signaling Technology), lapin anti-GFP (1:1000; A-6455, Invitrogen), lapin anti-RFP (1:1000; 600-401-379, Rockland), lapin anti-tyrosine hydroxylase (1 : 1000 ; AB152, Merck) et transporteur de glutamate anti-vésiculaire de lapin 2 (1 : 500 ; AF860, Frontier Institute). Les anticorps secondaires suivants utilisés (espèce hôte, âne) : anti-poulet DyLight 405 (1 : 250 ; 703-475-155, Jackson ImmunoResearch), anti-poulet Alexa Fluor 488 (1 : 500 ; 703-545-155, Jackson ImmunoResearch), anti-chèvre Alexa Fluor 405 (1:500; ab175665, Abcam), anti-chèvre Alexa Fluor 488 (1:500; ab150129, Abcam), anti-chèvre Alexa Fluor 555 (1:500; A-21432, Thermo Fisher Scientific ou ab150130, Abcam), anti-souris Alexa Fluor 488 (1:500, ab150109, Abcam), anti-souris Alexa Fluor 555 (1:500; ab150106, Abcam), anti-lapin Alexa Fluor 488 (1: 500 ; A-21206, Thermo fisher Scientific ou ab150073, Abcam), et anti-lapin Alexa Fluor 555 (1:500 ; ab150074, Abcam).

Pour la cartographie et le comptage des cellules dans le mésencéphale, des coupes coronales à 8,0 mm caudale du bregma ont été étudiées. Les niveaux rostrocaudaux des sections ont été validés par référence à des repères appropriés, tels que l'aqueduc cérébral, le gris périaqueducal, les racines sensorielles du nerf trijumeau, le pédoncule cérébelleux supérieur et les noyaux du colliculus supérieur et inférieur. La distribution des cellules marquées CTb dans le mésencéphale a été étudiée chez huit rats. Chez trois des huit rats, la distribution des cellules ChAT-immunoréactives a également été étudiée. Les cellules CTb-marquées et ChAT-immunoréactives ont été cartographiées sur des images numériques des sections originales avant d'être transcrites en sections standard fournies par Paxinos et Watson62, en utilisant à nouveau les points de repère appropriés.

Pour compter le nombre de cellules immunoréactives Fos dans les populations immunoréactives GFP ou ChAT dans la MLR, une tranche par rat a été choisie au hasard parmi 2 à 4 tranches successives. Les cellules immunoréactives ont été cartographiées sur des images numériques de coupes coronales originales comme décrit ci-dessus. Le nombre de cellules cartographiées dans le CnF et le PPTg, dont l'étendue a été définie conformément à l'atlas du cerveau du rat62 et par référence à la distribution des cellules ChAT-immunoréactives ainsi qu'aux repères appropriés, a été compté bilatéralement en double aveugle .

Les images de la section du cerveau utilisées dans les figures (Figs. 1a, c, e, i, 2a, e, 3a, 4a, 5a, Figs supplémentaires. 2a, 6a, 7a, 10) ont été créées en référence aux illustrations de Paxinos et Watson's atlas du cerveau du rat62.

Tout au long des expériences d'optogénétique in vivo, toutes les mesures analogiques ont été numérisées via le système d'acquisition de données du convertisseur AD (PowerLab 8/30 ou 8/35 ; ADInstruments), affichées en continu sur un écran d'ordinateur et enregistrées numériquement à un taux d'échantillonnage de 1 kHz sur un disque dur à l'aide du logiciel LabChart (v8.0 ou 8.1.16 ; ADInstruments). MAP et HR ont été calculés post hoc battement par battement et rééchantillonnés à 1 kHz. La vue aérienne de l'expérience utilisant des rats conscients a été capturée en continu avec une caméra Web HD (C920; Logicool) connectée à un ordinateur, et les données vidéo ont été stockées à un taux de 10 images par s (fps).

Dans les expériences optogénétiques menées chez des rats anesthésiés ou décérébrés, les valeurs de base ont été obtenues à partir de moyennes pendant 15, 30 ou 60 s avant les interventions optogénétiques. Les valeurs moyennes pour 1 s immédiatement avant chaque courte période (0,5 s) de période de photostimulation pendant le protocole de stimulation intermittente de 1 min ont également été déterminées pour examiner les réponses RSNA et VRNA à la photostimulation. Dans des expériences visant à étudier les effets de la stimulation optogénétique via l'activation de ChR2 chez des rats conscients, les valeurs de base ont été obtenues à partir de moyennes de 15 s avant le début de l'illumination laser. Dans des expériences visant à étudier l'effet de l'inhibition optogénétique via l'activation iChloC chez des rats conscients, les valeurs moyennes pendant la période de 2 s immédiatement avant l'illumination laser ont été déterminées comme ligne de base. Les valeurs de référence sont présentées dans les tableaux supplémentaires 1 à 14.

Pour quantifier les réponses RSNA et VRNA à la photostimulation, après l'obtention de signaux rectifiés pleine onde de ces activités nerveuses périphériques, ainsi que des signaux de bruit de fond, la composante de bruit pour le RSNA ou VRNA a été soustraite du signal rectifié. Les réponses RSNA et VRNA aux interventions optogénétiques ont été quantifiées en tant que changements relatifs par rapport aux valeurs de base, qui ont été notées 100 %. Des procédures supplémentaires, c'est-à-dire une analyse de superposition et de moyenne, ont été menées pour quantifier le RSNA et le VRNA en réponse à une période de photostimulation de 0, 5 s pendant un protocole de stimulation intermittente de 1 min. Les changements relatifs du RSNA ou du VRNA par rapport à la ligne de base ont été rééchantillonnés à 1 kHz en réponse à chaque période de photostimulation de 0, 5 s, avant d'être superposés les uns aux autres et moyennés au point temporel (Fig. 2c). Les valeurs de l'ASC des modifications moyennes du RSNA ont également été calculées en tant qu'indice des réponses du RSNA à la photostimulation en intégrant les augmentations des modifications du RSNA par rapport à la ligne de base pendant la période suivant l'analyse de superposition et de moyenne (Fig. 2c).

Des vidéos ont été enregistrées à 10 images par seconde au cours d'expériences pour étudier l'effet de la stimulation optogénétique chez des rats conscients ; ceux-ci ont été analysés pour calculer la vitesse locomotrice à l'aide d'un système de suivi vidéo conformément à son manuel (SMART ver. 3.0; Panlab). Pour déterminer le contour du rat dans chaque image d'une séquence vidéo, une image de la zone expérimentale (piste circulaire) sans rat a été utilisée comme référence et comparée à l'une des images vidéo de l'expérience contenant le rat. La différence entre les deux images a ensuite été détectée par le système. En détectant consécutivement le centre de masse du rat dans chaque image, le suivi du mouvement a été réalisé sur 200 ms. Par la suite, la vitesse instantanée du rat dans la piste circulaire a été calculée sans lissage. Des vidéos enregistrées lors d'expériences pour étudier l'effet de l'inhibition optogénétique chez des rats conscients ont été utilisées pour valider les valeurs de WRR calculées à l'aide de la méthode décrite ci-dessus.

Les données ont été exclues des résultats dans les cas où les injections manquaient la région ciblée, les extrémités des fibres optiques étaient mal situées, la déconnexion des signaux de télémétrie s'est produite pendant la stimulation optogénétique pendant plus de 1 s, ou les rats n'étaient pas disposés à courir volontairement sur la roue.

Toutes les mesures ont été exportées dans Excel (Microsoft). Toutes les analyses statistiques ont été effectuées dans SigmaPlot 14.0 (Systat Software, Inc). Pour les comparaisons entre groupes indépendants, les données ont été analysées par le test t de Welch si elles étaient normalement distribuées (évaluées à l'aide du test de Shapiro-Wilk) ou par un test Mann-Whitney U si elles n'étaient pas normalement distribuées. Pour les échantillons appariés entre les essais, les données ont été analysées par des tests t appariés. Pour les échantillons répétés parmi les essais ou les changements dans le temps, les données ont été analysées par une ANOVA à mesures répétées unidirectionnelle (ANOVA RM) ou par une ANOVA RM unidirectionnelle de Friedman par rang où les hypothèses de normalité (test de Shapiro-Wilk) et/ou d'égale variance ( test de Brown-Forsythe) n'ont pas été satisfaits dans l'ANOVA. Pour les échantillons répétés parmi les essais entre groupes indépendants, les données ont été analysées par ANOVA RM bidirectionnelle. Le cas échéant, ces procédures ANOVA ont été suivies par le test post hoc de Dunnett, Holm-Sidak ou Tukey. Tous les tests étaient bilatéraux. Les tests utilisés pour présenter chaque graphique sous forme de chiffres et d'autres informations statistiques, y compris les valeurs statistiques F/t/χ2 et les degrés de liberté, sont présentés dans le tableau supplémentaire 15. P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif. Les données sont exprimées sous forme de moyennes avec erreurs standard (SEM).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données associées à cette étude sont fournies dans cet article publié et ses fichiers d'informations complémentaires. Les données sources sont fournies avec ce document.

Tout le code utilisé pour analyser les réponses sympathiques et cardiovasculaires est disponible sur OSF : https://osf.io/tuhgm/.

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Cette recherche a été soutenue par une subvention JSPS KAKENHI pour la recherche scientifique (B) (21H03321) (SK); une subvention JSPS KAKENHI pour la recherche scientifique (B) (18H03151) (SK); une subvention JSPS KAKENHI pour jeunes scientifiques (A) (15H05367) (SK); une subvention JSPS KAKENHI pour la recherche stimulante (exploratoire) (20K21759) (SK); une subvention JSPS KAKENHI pour la recherche scientifique (C) (22K06470) (N.Ka.); une subvention JSPS KAKENHI pour la recherche scientifique (C) (19K06954) (N.Ka.); une subvention JSPS KAKENHI pour la recherche scientifique (B) (20H03418) (KN); par AMED (JP21wm0525002 à N.Ka. ; JP21gm5010002 à KN) ; par JST Moonshot R&D (JPMJMS2023 à KN); et des subventions de la Takeda Science Foundation (SK). Nous remercions Yui Yamane, Koji Maruyama, Atsuki Otake, Yumi Ono et Eri Hanai pour leur aide dans les expériences et le comptage manuel des cellules en double aveugle, ainsi que le Tottori Bio Frontier géré par la préfecture de Tottori, au Japon, pour l'utilisation de la microscopie confocale système.

Division de physiologie intégrative, Faculté de médecine de l'Université Tottori, Yonago, Japon

Satoshi Koba, Nao Kumada, Emi Narai et Tatsuo Watanabe

Division des biosciences intégratives, École supérieure des sciences médicales de l'Université de Tottori, Yonago, Japon

Kumada aussi

Département de physiologie intégrative, École supérieure de médecine de l'Université de Nagoya, Nagoya, Japon

Naoya Kataoka et Kazuhiro Nakamura

Institut universitaire de recherche avancée de Nagoya, Nagoya, Japon

Naoya Kataoka

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SK a conçu l'étude. SK et N.Ku ont conçu des expériences avec la contribution de N.Ka. et KNSK, N.Ka., KN et TW ont préparé du matériel d'étude. N.Ku. et SK ont réalisé des expériences et analysé des données. SK, N.Ku., et EN chiffres préparés. SK, N.Ku. et KN ont discuté des données. SK et KN ont rédigé le manuscrit avec la contribution de tous les co-auteurs.

Correspondance à Satoshi Koba.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie le(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Koba, S., Kumada, N., Narai, E. et al. Une voie excitatrice monosynaptique du tronc cérébral qui pilote les activités locomotrices et les réponses cardiovasculaires sympathiques. Nat Commun 13, 5079 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32823-x

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Reçu : 10 septembre 2021

Accepté : 18 août 2022

Publié: 29 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32823-x

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