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Mar 31, 2023

Endomicroscope laser confocal avec scanner MEMS distal pour de vrais

Rapports scientifiques volume 12,

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 20155 (2022) Citer cet article

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L'endomicroscopie laser confocale est une méthodologie émergente pour effectuer une biopsie optique en temps réel. Des images de fluorescence avec une qualité histologique peuvent être collectées instantanément à partir de l'épithélium d'organes creux. Actuellement, la numérisation est effectuée à l'extrémité proximale des instruments à sonde utilisés couramment en clinique, et la flexibilité pour contrôler la mise au point est limitée. Nous démontrons l'utilisation d'un scanner à résonance paramétrique emballé dans l'extrémité distale de l'endomicroscope pour effectuer des déviations latérales à grande vitesse. Une ouverture a été gravée au centre du réflecteur pour replier le chemin optique. Cette conception a réduit les dimensions de l'instrument à 2,4 mm de diamètre et 10 mm de longueur, permettant un passage vers l'avant à travers le canal de travail d'un endoscope médical standard. Un assemblage de lentilles compact offre une résolution latérale et axiale de 1,1 et 13,6 μm, respectivement. Une distance de travail de 0 μm et un champ de vision de 250 μm × 250 μm ont été obtenus à des fréquences d'images allant jusqu'à 20 Hz. Une excitation à 488 nm a été délivrée pour exciter la fluorescéine, un colorant approuvé par la FDA, afin de générer un contraste tissulaire élevé. L'endomicroscope a été retraité en utilisant une méthode de stérilisation cliniquement approuvée pendant 18 cycles sans échec. Des images de fluorescence ont été recueillies au cours d'une coloscopie de routine à partir de muqueuse colique normale, d'adénomes tubulaires, de polypes hyperplasiques, de rectocolite hémorragique et de colite de Crohn. Des cellules individuelles, y compris des colonocytes, des cellules caliciformes et des cellules inflammatoires, ont pu être identifiées. Les caractéristiques muqueuses, telles que les structures des cryptes, les lumières des cryptes et la lamina propria, ont pu être distinguées. Cet instrument a le potentiel d'être utilisé comme accessoire lors d'une endoscopie médicale de routine.

L'endomicroscopie laser confocale est une modalité d'imagerie émergente en cours de développement pour une utilisation clinique en tant qu'accessoire de l'endoscopie médicale de routine1,2,3. Ces instruments flexibles couplés à des fibres peuvent être utilisés pour identifier les maladies de l'épithélium qui tapisse les organes creux, tels que le côlon. Cette fine couche de tissu est hautement active sur le plan métabolique et est à l'origine de nombreux processus pathologiques, tels que le cancer, l'infection et l'inflammation. L'endomicroscopie peut atteindre une résolution sous-cellulaire pour fournir des images in vivo avec une qualité "similaire à l'histologie" en temps réel pour guider les médecins dans la prise de décisions cliniques. La biopsie physique des tissus comporte un risque de saignement et de perforation. Souvent, trop ou trop peu de biopsies sont prélevées. Chaque spécimen réséqué augmente le coût de la procédure. Plusieurs jours sont nécessaires pour traiter le spécimen en vue de son évaluation par un pathologiste. Les patients éprouvent souvent de l'anxiété en attendant plusieurs jours que les résultats de la pathologie soient disponibles. En comparaison, d'autres méthodes d'imagerie clinique, telles que l'IRM, la TDM, la TEP, la SPECT et l'échographie, manquent de la résolution spatiale et des vitesses temporelles nécessaires pour visualiser les processus épithéliaux avec une résolution subcellulaire in vivo en temps réel.

Un instrument à base de sonde (Cellvizio) est actuellement utilisé en routine dans la clinique pour effectuer une "biopsie optique". La conception est basée sur un faisceau de fibres spatialement cohérent qui collecte et transmet des images de fluorescence4. Les noyaux des fibres individuelles servent de "trous d'épingle" pour filtrer spatialement la lumière hors foyer pour obtenir une résolution sous-cellulaire. Le balayage est effectué à l'extrémité proximale à l'aide de grands galvos volumineux. Cet emplacement limite la capacité de l'instrument à contrôler la mise au point. La stadification adéquate des cancers épithéliaux précoces nécessite une visualisation sous la surface des tissus pour évaluer l'invasion afin de déterminer le traitement approprié. La fluorescéine, un agent de contraste approuvé par la FDA, est injectée par voie intraveineuse pour mettre en évidence les caractéristiques structurelles de l'épithélium. Ces endomicroscopes ont des dimensions inférieures à 2,4 mm de diamètre et peuvent être passés facilement dans le canal de biopsie des endoscopes médicaux standard. Cette flexibilité permet une large utilisation clinique et est indépendante du fabricant de l'endoscope. De nombreuses études cliniques ont été réalisées à l'aide de cet instrument d'imagerie, notamment dans l'œsophage, l'estomac, le côlon et la cavité buccale, pour la détection précoce du cancer. Des protocoles d'imagerie ont été établis et la sécurité de cette procédure a été déterminée.

Les systèmes microélectromécaniques (MEMS) sont une technologie puissante pour concevoir et fabriquer des mécanismes de balayage miniatures à utiliser dans l'extrémité distale des endomicroscopes. Cet emplacement (versus proximal) offre une plus grande flexibilité pour contrôler la position du foyer5,6. En plus des déviations latérales, les mécanismes distaux peuvent effectuer un balayage axial, post-objectif et à accès aléatoire. Ces fonctions permettent une interrogation plus complète de l'épithélium, y compris l'imagerie en coupe verticale7, un balayage sans aberration sur un grand champ de vision (FOV)8 et des performances améliorées dans les sous-régions définies par l'utilisateur9, respectivement. MEMS répond aux défis considérables posés par l'espace limité disponible dans la pointe distale de l'instrument pour emballer le mécanisme de balayage. Par rapport aux galvos volumineux, le MEMS offre des performances supérieures dans un petit facteur de forme avec une vitesse élevée et une faible puissance. Des processus de fabrication simples peuvent être mis à l'échelle pour une fabrication de masse à faible coût. Un certain nombre de conceptions de MEMS ont été signalées précédemment10,11,12. Aucun n'a été suffisamment développé pour effectuer une imagerie in vivo en temps réel via le canal de travail d'un endoscope médical afin de permettre une large traduction clinique. Ici, nous visons à démontrer l'utilisation d'un scanner MEMS dans la pointe distale d'un endomicroscope pour collecter des images in vivo chez des sujets humains lors d'une endoscopie clinique de routine.

Un instrument couplé à des fibres a été développé à l'aide d'un scanner MEMS dans la pointe distale pour collecter des images de fluorescence en temps réel in vivo avec des caractéristiques de type histologie. Une fibre monomode (SMF) a été enfermée dans un tube en polymère flexible et a délivré une excitation à λex = 488 nm. Cette configuration raccourcit la longueur de la pointe distale et permet un passage vers l'avant à travers le canal de travail des endoscopes médicaux standard. Une férule a été utilisée pour centrer les composants optiques. Les lentilles ont été conçues pour obtenir une résolution proche de la limite de diffraction sur l'axe avec une ouverture numérique (NA) = 0,41 et une distance de travail = 0 μm13. Des entretoises de précision ont été fabriquées pour aligner avec précision les optiques14. Le scanner a été emballé dans un endomicroscope avec une pointe distale rigide de 2,4 mm de diamètre et 10 mm de longueur (Fig. 1a). Ces dimensions permettent une utilisation clinique comme accessoire lors d'une endoscopie (Fig. 1b). La puissance laser maximale incidente sur le tissu était de 2 mW.

Endomicroscope laser confocal (CLE) et scanner MEMS. La photo montre (a) l'instrument emballé avec des dimensions de pointe distale rigide de 2,4 mm de diamètre et 10 mm de longueur, et (b) le passage vers l'avant à travers le canal de travail d'un endoscope médical standard (Olympus CF-HQ190L). (c) La vue de face du scanner montre un réflecteur avec une ouverture centrale de 50 μm de diamètre pour permettre au faisceau d'excitation de passer. Le scanner est monté sur un cardan entraîné par un ensemble d'actionneurs à peigne orthogonal. Les fréquences de résonance de ce dispositif sont déterminées par les dimensions des ressorts de torsion. (d) La vue latérale du scanner montre un scanner monté sur le support avec des fils à des ancres d'électrode qui fournissent des points de connexion pour les signaux d'entraînement et l'alimentation.

Le mécanisme de balayage consistait en un réflecteur monté sur un cardan entraîné par un ensemble d'actionneurs à peigne orthogonal pour dévier le faisceau latéralement (plan XY) selon un motif de Lissajous (Fig. 1c). Une ouverture de 50 μm de diamètre a été gravée au centre pour laisser passer le faisceau d'excitation. Le scanner était piloté près des fréquences de résonance de la structure, qui pouvaient être ajustées en modifiant les dimensions des ressorts de torsion. Des ancres d'électrode ont été gravées autour de la périphérie de l'appareil pour fournir des points de connexion pour l'alimentation et le signal d'entraînement (Fig. 1d).

Le système d'imagerie était disposé sur un chariot portable qui pouvait être transporté dans la salle d'intervention. Une interface utilisateur graphique a été développée pour aider les utilisateurs ayant une expertise technique minimale, tels que les médecins et les infirmières. La fréquence d'entraînement du scanner, le modèle de forme du faisceau et le champ de vision de l'image ont été vérifiés manuellement.

La longueur totale de l'endomicroscope était d'environ 4 m pour permettre à l'instrument de passer complètement à travers le canal de travail (1,68 m) d'un endoscope médical standard avec une longueur supplémentaire pour la maniabilité. À l'extrémité proximale de l'endomicroscope, le SMF et les fils étaient terminés par des connecteurs, qui étaient insérés dans les ports de fibre et de fil de la station de base. Cette unité contenait le laser, le bloc de filtre optique, les amplificateurs haute tension et le détecteur à tube photomultiplicateur (PMT). Les amplificateurs fournissaient l'alimentation et les signaux d'entraînement au scanner. Le bloc de filtre optique a couplé l'excitation laser dans le SMF et a fourni une fluorescence au PMT.

L'endomicroscope a été retraité après chaque procédure clinique en utilisant le procédé de stérilisation STERRAD et a survécu jusqu'à 18 cycles sans défaillance. Pour la solution OPA, aucun signe de dommage n'a été trouvé après plus de 10 cycles de désinfection. Les résultats pour l'OPA étaient meilleurs qu'avec STERRAD, et suggèrent que la durée de vie des endomicroscopes peut être prolongée avec une désinfection de haut niveau plutôt qu'une stérilisation pour le retraitement.

La résolution de l'image a été déterminée par la fonction d'étalement des points en utilisant des billes fluorescentes de 0,1 μm de diamètre. Une pleine largeur à mi-hauteur (FWHM) de 1, 1 et 13, 6 μm a été mesurée pour la résolution latérale et axiale, respectivement (Fig. 2a, b).

Paramètres d'image. ( a ) La résolution latérale et ( b ) axiale de l'optique de focalisation a été caractérisée par une fonction d'étalement de points (PSF) mesurée à l'aide de microsphères fluorescentes de 0, 1 μm de diamètre. Une pleine largeur demi-maximale (FWHM) de 1,1 et 13,6 μm, respectivement, a été mesurée. En médaillon : vue agrandie de microsphères simples dans les directions latérale (XY) et axiale (XZ). ( c ) Une image de fluorescence collectée à partir d'une barre cible standard (USAF 1951) (ovale rouge) montre que le groupe 7–6 peut être clairement résolu. ( d ) Une image de microsphères fluorescentes dispersées de 10 μm de diamètre montre une image FOV de 250 μm × 250 μm. Les PSF dans (a, b) ont été tracées à l'aide de MATLAB R2019a (https://www.mathworks.com/). (c, d) Les images de fluorescence ont été collectées à l'aide de LabVIEW 2021 (https://www.ni.com/).

Une image de fluorescence d'une cible de résolution standard distingue clairement l'ensemble de barres du groupe 7-6 pour prendre en charge une résolution latérale élevée (Fig. 2c). Un champ de vision (FOV) de 250 μm × 250 μm a été déterminé à partir d'une image de billes fluorescentes de 10 μm de diamètre dispersées sur une lamelle de verre (Fig. 2d).

Des méthodes automatisées pour le contrôle du gain PMT et la correction de phase ont été mises en œuvre dans le système d'imagerie clinique pour atténuer l'artefact de mouvement de l'endoscope, du péristaltisme du côlon et de la respiration du patient. Les algorithmes de reconstruction et de traitement d'image ont été décrits précédemment14,15. Le gain PMT a été ajusté à l'aide d'un contrôleur proportionnel-intégral (PI) pour éviter la saturation d'intensité16. Le système lit une intensité de pixel maximale par image, calcule la réponse proportionnelle et intégrale, et détermine une valeur pour le gain PMT afin de fournir des intensités de pixel dans une plage acceptable.

Au cours de l'imagerie in vivo, un décalage de phase entre le mouvement du scanner et le signal de commande peut entraîner des images floues. Cet effet peut provenir de variations de température avec l'instrument à l'intérieur du corps humain. Une image en lumière blanche montre l'endomicroscope mis en contact avec la muqueuse colique normale in vivo (Fig. 3a). Le flou dû aux pixels mal enregistrés peut être observé sur l'image non traitée de la muqueuse colique normale (Fig. 3b). Après traitement en utilisant le réglage de phase et de contraste correct, les caractéristiques sous-cellulaires de la muqueuse ont pu être distinguées (Fig. 3c). Dans les informations supplémentaires, les images confocales brutes et traitées en temps réel sont fournies sur la figure S1, et les paramètres de reconstruction d'image utilisés pour le temps réel et le post-traitement sont fournis dans les tableaux S1 et S2.

Traitement d'image. (a) L'image endoscopique à champ large montre l'endomicroscope (E) placé en contact avec la muqueuse colique normale (N) pour la collecte d'images de fluorescence in vivo après l'administration de fluorescéine. (b) La dérive de phase des axes X et Y pendant le balayage peut entraîner un flou dû à des pixels mal enregistrés. De grands déphasages ont été appliqués à l'image originale pour la démonstration. (c) Après la correction de phase post-traitée, les détails de la muqueuse peuvent être appréciés, y compris la structure de la crypte (flèche) avec la lumière centrale (l) entourée de lamina propria (lp). Les cellules individuelles peuvent être distinguées, y compris les colonocytes (c), les cellules caliciformes (g) et les cellules inflammatoires (tête de flèche). Voir la vidéo supplémentaire 1. (b, c) Les images ont été traitées à l'aide de LabVIEW 2021.

Des images de fluorescence confocale ont été collectées in vivo à partir de plusieurs conditions pathologiques dans le côlon pour démontrer la large applicabilité clinique de cet instrument. L'imagerie à grand champ a d'abord été réalisée à l'aide d'un éclairage à lumière blanche pour identifier les muqueuses apparaissant grossièrement anormales. L'endomicroscope a ensuite été passé dans le canal opérateur du coloscope et mis en contact avec la muqueuse.

Des images d'endoscopie à champ large, d'endomicroscopie confocale et d'histologie (H&E) sont présentées pour la néoplasie colique, y compris l'adénome tubulaire et le polype hyperplasique. L'adénome tubulaire montre une perte de l'architecture normale de la crypte, une diminution de la taille des cellules caliciformes, des lumières de crypte déformées et une lamina propria encombrée (Fig. 4a – c). Le polype hyperplasique présente une structure de crypte étoilée, quelques cellules caliciformes, des lumières de crypte en forme de fente et une lamina propria irrégulière (Fig. 4d – f).

Images in vivo de la muqueuse colique. Des images représentatives d'endoscopie à lumière blanche, d'endomicroscope confocal et d'histologie (H&E) sont présentées pour l'adénome (ac), le polype hyperplasique (df), la colite ulcéreuse (gi) et la colite de Crohn (jl). (b) L'image confocale recueillie avec l'endomicroscope (E) in vivo d'un adénome tubulaire (TA) est montrée. Cette lésion pré-maligne montre une perte de l'architecture normale de la crypte (flèche), des lumières de crypte déformées (l) et une lamina propria (lp) encombrée. Les colonocytes (c), les cellules caliciformes (g) et les cellules inflammatoires (tête de flèche) peuvent également être identifiés. Voir la vidéo supplémentaire 2. (e) L'image confocale collectée in vivo à partir d'un polype hyperplasique (HP) est montrée. Cette lésion bénigne montre une structure de crypte étoilée (flèche), des lumières de crypte en forme de fente (l) et une lamina propria irrégulière (lp). Des colonocytes (c), quelques cellules caliciformes (g) et des cellules inflammatoires (tête de flèche) peuvent également être identifiés. Voir la vidéo supplémentaire 3. (h) L'image confocale collectée in vivo à partir de la colite ulcéreuse (UC) est montrée. Cette condition inflammatoire montre une architecture de crypte déformée (flèches) avec des cellules caliciformes proéminentes (g). Des panaches de fluorescéine (f) sortent de l'épithélium, reflétant une perméabilité vasculaire accrue. De nombreuses cellules inflammatoires (têtes de flèches) peuvent être observées dans la lamina propria (lp). Voir la vidéo supplémentaire 4. (k) L'image confocale collectée in vivo à partir de zones inégales de la colite de Crohn (CC) est montrée. Cette condition inflammatoire montre une architecture de crypte déformée (flèches) avec des cellules caliciformes proéminentes (g). Des panaches de fluorescéine (f) sortent de l'épithélium, reflétant une perméabilité vasculaire accrue. De nombreuses cellules inflammatoires (têtes de flèches) peuvent être observées dans la lamina propria (lp). Voir la vidéo supplémentaire 5. (b, e, h, k) Les images ont été traitées à l'aide de LabVIEW 2021.

Un ensemble similaire d'images est montré pour l'inflammation du côlon, y compris la colite ulcéreuse (CU) (Fig. 4g – i) et la colite de Crohn (Fig. 4j – l). Une réaction inflammatoire peut être appréciée caractérisée par une architecture de crypte déformée avec des cellules caliciformes proéminentes. La fluorescéine s'extrude de l'épithélium, reflet d'une perméabilité vasculaire accrue. De nombreuses cellules inflammatoires peuvent être observées dans la lamina propria.

Nous avons démontré l'utilisation clinique d'un endomicroscope laser confocal à fibre flexible à l'aide d'un scanner MEMS situé à l'extrémité distale pour collecter des images in vivo. Aux fréquences de résonance, des fréquences d'images allant jusqu'à 20 Hz ont été obtenues avec un motif de balayage Lissajous à haute densité pour atténuer les artefacts de mouvement. Le chemin optique a été replié pour permettre au faisceau de se dilater et de générer une NA suffisante pour atteindre une résolution latérale de 1,1 μm. Des images de fluorescence ont été recueillies avec une qualité histologique au cours d'une coloscopie de routine de la muqueuse colique normale, des adénomes tubulaires, des polypes hyperplasiques, de la colite ulcéreuse et de la colite de Crohn. Des cellules individuelles, y compris des colonocytes, des cellules caliciformes et des cellules inflammatoires, ont pu être identifiées. Les caractéristiques muqueuses, telles que les structures des cryptes, les lumières des cryptes et la lamina propria, ont pu être distinguées. Des appareils de précision ont été microfabriqués pour fournir un alignement précis des composants optiques et mécaniques individuels dans un instrument de 2,4 mm de diamètre et de 10 mm de longueur. La conception optique a réduit de manière adéquate la longueur de la pointe distale rigide pour permettre le passage vers l'avant à travers un canal de travail aux dimensions standard (3,2 mm de diamètre) dans les endoscopes médicaux. Cet instrument peut donc être largement utilisé par les médecins de ville quel que soit le fabricant. Une excitation à λex = 488 nm a été délivrée pour exciter la fluorescéine, un colorant approuvé par la FDA, pour générer un contraste élevé. L'instrument a été retraité en utilisant des méthodes de stérilisation cliniquement approuvées pendant 18 cycles sans échec.

Deux autres conceptions d'instruments ont été démontrées dans la clinique. Le Cellvizio (Mauna Kea Technologies) est un endomicroscope laser confocal à sonde (pCLE) qui utilise un faisceau de fibres optiques cohérentes multimodes pour collecter et transmettre des images de fluorescence1. Un galvo situé dans la station de base effectue un balayage latéral à l'extrémité proximale. Les coupes optiques sont collectées dans le plan horizontal (XY) à des profondeurs de 0 à 70 μm. Un jeu de minisondes de diamètres allant de 0,91 (aiguille 19 G) à 5 mm est disponible. Une résolution latérale entre 1 et 3,5 μm a été atteinte. Les images sont collectées à des fréquences d'images entre 9 et 12 Hz avec un FOV entre 240 et 600 μm dans une dimension. Cette plate-forme a été utilisée cliniquement dans un certain nombre d'applications, notamment dans les voies biliaires, la vessie, le côlon, l'œsophage, les poumons et le pancréas. Optiscan Pty Ltd a développé un endomicroscope laser confocal à base d'endoscope (eCLE) avec le mécanisme de balayage intégré dans le tube d'insertion (extrémité distale) d'un endoscope spécialisé (EC-3870K, Pentax Precision Instrument)17. Une fibre monomode a été utilisée pour effectuer la section optique, et le balayage latéral a été effectué à l'aide d'un mécanisme en porte-à-faux par un diapason résonant. Un actionneur en alliage à mémoire de forme (Nitinol) a été utilisé pour générer un déplacement axial. Le diamètre global du module confocal était de 5 mm. Une lentille GRIN avec NA = 0,6 a été utilisée pour la mise au point. Les images horizontales ont été collectées avec une résolution latérale et axiale de 0,7 et 7 μm, respectivement, à des fréquences d'images de 0,8-1,6 Hz avec un FOV de 500 μm × 500 μm.

Nous avons démontré l'utilisation d'un scanner MEMS situé dans la pointe distale pour collecter des images de fluorescence in vivo avec une résolution sous-cellulaire de sujets humains via un endoscope médical. La fluorescence fournit un contraste d'image élevé et les ligands qui se lient aux cibles de la surface cellulaire peuvent être marqués avec des fluorophores pour fournir des propriétés moléculaires permettant d'améliorer le diagnostic de la maladie18. D'autres méthodes optiques sont en cours de développement pour l'endomicroscopie in vivo. L'OCT utilise la courte longueur de cohérence d'une source lumineuse à large bande pour collecter des images dans le plan vertical avec des profondeurs > 1 mm19. Cependant, cette méthodologie à faible contraste est basée sur la collecte de la lumière rétrodiffusée, et la résolution de l'image est limitée par l'artefact de chatoiement. L'endomicroscopie photoacoustique génère des images in vivo basées sur une expansion thermoélastique rapide dans les tissus suite à l'absorption d'une impulsion laser, et génère une onde acoustique20. Cette approche a démontré des profondeurs d'imagerie> 1 cm dans le côlon humain in vivo pour surveiller la thérapie. Le contraste est généré principalement à partir de l'hémoglobine dans le système vasculaire. L'endomicroscopie multiphotonique génère des images de fluorescence à contraste élevé lorsque deux ou plusieurs photons NIR arrivent simultanément sur une biomolécule tissulaire21. Cette approche peut atteindre des profondeurs d'imagerie> 1 mm avec une faible phototoxicité. Des impulsions laser femtoseconde de haute intensité sont nécessaires, et cette modalité n'a pas été démontrée cliniquement au cours de l'endoscopie.

Dans ce prototype, le scanner effectuait uniquement une déviation latérale, ainsi les sections optiques étaient affichées dans le plan horizontal (XY). Cet appareil a pu atteindre des fréquences d'images (20 Hz) supérieures par rapport aux galvos du système Cellvizio (12 Hz). La fréquence d'images a été augmentée pour atténuer l'artefact de mouvement et diminuée pour augmenter le signal. Des vitesses élevées et des algorithmes automatisés seront nécessaires pour atténuer les artefacts de mouvement importants dus au mouvement de l'endoscope, au mouvement respiratoire et au péristaltisme intestinal. Il a été démontré que les scanners à résonance paramétrique permettent d'obtenir des déplacements axiaux de plusieurs centaines de microns22. Les images peuvent être collectées dans le plan vertical (XZ), perpendiculaire à la surface muqueuse, pour fournir la même vue que celle de l'histologie (H&E). Le scanner peut être placé dans la position post-objectif où le faisceau d'éclairage est incident le long de l'axe optique principal pour réduire la sensibilité aux aberrations8. Un volume focal proche de la diffraction limitée peut être dévié sur un FOV arbitrairement grand. Un balayage à accès aléatoire peut être effectué pour dévier le réflecteur dans des positions définies par l'utilisateur9. Le FOV peut être réduit pour mettre en évidence des sous-régions d'image arbitraires afin d'améliorer le rapport signal sur bruit, le contraste et la fréquence d'images. Les scanners peuvent être fabriqués par lots à l'aide de processus simples. Des centaines de dispositifs peuvent être produits sur chaque plaquette de silicium afin d'augmenter la production pour une fabrication de masse et une large diffusion à faible coût.

Le chemin optique plié a réduit les dimensions de la pointe distale rigide pour permettre une utilisation transparente de l'endomicroscope comme accessoire lors d'une coloscopie de routine. Dans les images de fluorescence présentées, les caractéristiques de la muqueuse sous-cellulaire peuvent être visualisées pour distinguer les adénomes tubulaires (pré-malignes) des polypes hyperplasiques (bénins). Ces résultats démontrent le potentiel de l'endomicroscopie pour réduire les biopsies inutiles23. Les complications globales liées à la procédure peuvent être réduites, les intervalles de surveillance peuvent être optimisés et l'analyse histologique des lésions insignifiantes peut être minimisée. Nous avons également démontré des images in vivo de patients atteints de maladies inflammatoires de l'intestin, y compris la colite ulcéreuse (CU) et la colite de Crohn. La coloscopie conventionnelle en lumière blanche fournit un aspect macroscopique de la surface muqueuse avec une capacité limitée à évaluer avec précision la cicatrisation muqueuse. L'endomicroscopie peut être utilisée in vivo pour évaluer l'efficacité des thérapies biologiques, telles que les anticorps anti-TNF24. Une évaluation in vivo précise peut également réduire ou prévenir les rechutes et les complications de la maladie, telles que la chirurgie, et améliorer la qualité de vie. Dans l'étude clinique, aucun effet indésirable grave lié à l'utilisation in vivo de l'endomicroscope avec la fluorescéine n'a été signalé25. La puissance du laser sur la surface de la muqueuse était limitée à <2 mW pour minimiser le risque de blessure thermique et répondre aux exigences de la FDA pour les risques non significatifs26 selon 21 CFR 812.

La conception de cet instrument peut être modifiée pour améliorer les performances d'imagerie. Des optiques personnalisées peuvent être utilisées pour réduire les aberrations sphériques, améliorer la résolution de l'image et augmenter la distance de travail. Le SIL peut être adapté pour mieux correspondre à l'indice de réfraction des tissus (~ 1,4) afin d'améliorer le couplage de la lumière. La fréquence d'entraînement peut être réglée pour augmenter l'angle de déviation latérale du scanner afin d'agrandir le champ de vision de l'image. Des méthodes automatisées peuvent être mises en œuvre pour supprimer les cadres d'image avec un mouvement important afin d'atténuer cet effet. Un réseau prédiffusé programmable sur le terrain (FPGA) avec acquisition de données à grande vitesse sera mis en œuvre pour obtenir une correction haute performance en plein cadre en temps réel. Pour une plus grande utilité clinique, les méthodes automatisées doivent corriger les déphasages et les artefacts de mouvement pour interpréter les images en temps réel. Un scanner monolithique à résonance paramétrique à 3 axes peut être mis en œuvre pour introduire un balayage axial22. Ces dispositifs ont été développés pour obtenir un déplacement vertical sans précédent > 400 µm en réglant la fréquence d'entraînement dans un régime qui présente une dynamique mixte d'adoucissement/renforcement27. À l'avenir, l'imagerie en coupe verticale pourrait être utile pour la stadification du cancer précoce (T1a). Un circuit de détection capacitif peut être mis en œuvre pour suivre le mouvement du scanner et corriger les déphasages28. L'étalonnage de phase automatisé à l'aide d'un circuit de détection peut remplacer l'étalonnage manuel avant l'utilisation de l'instrument. La fiabilité de l'instrument peut être améliorée grâce à l'utilisation de méthodes plus robustes pour sceller l'instrument afin d'augmenter le nombre de cycles de retraitement. La technologie MEMS promet d'accélérer l'utilisation des endomicroscopes pour visualiser l'épithélium des organes creux afin de diagnostiquer la maladie et de surveiller le traitement de manière peu invasive. Avec un développement ultérieur, cette méthodologie d'imagerie émergente peut devenir une solution peu coûteuse à utiliser comme accessoire à l'endoscopie médicale pour fournir une histologie instantanée et peut éventuellement remplacer l'analyse pathologique conventionnelle.

Des simulations de lancer de rayons ont été réalisées à l'aide du logiciel de conception optique ZEMAX (ver 2013) pour définir les paramètres de l'optique de focalisation. Les critères de conception comprenaient une résolution proche de la diffraction limitée sur l'axe, une distance de travail = 0 μm et un champ de vision (FOV) supérieur à 250 × 250 μm2. Une fibre monomode (SMF) a été utilisée pour délivrer une excitation à λex = 488 nm. Des doublets achromatiques ont été utilisés pour atténuer la dispersion chromatique pour la collecte de fluorescence (Fig. 5a). Le faisceau a été délivré à travers un SMF avec un diamètre de champ de mode de 3, 5 μm et passe au centre du réflecteur avec une ouverture de 50 μm de diamètre sans troncature. Une lentille à immersion solide (demi-boule) avec un indice de réfraction élevé (n = 2,03) a été utilisée pour minimiser les aberrations sphériques du faisceau incident et fournir un contact complet avec la surface muqueuse. L'optique de focalisation fournit un NA total = 0,41, où NA = nsinα, n est l'indice de réfraction du tissu et α est l'angle de convergence maximum du faisceau. La limite de diffraction pour la résolution latérale et axiale est de 0,44 et 6,65 μm, respectivement, en utilisant des valeurs de NA = 0,41, λ = 488 nm et n = 1,3313. Seules les lentilles disponibles dans le commerce avec un diamètre extérieur (OD) ≤ 2 mm ont été prises en compte. Le chemin optique a été plié de sorte que le faisceau sortant du SMF passait à travers une ouverture centrale dans le scanner et était réfléchi vers l'arrière par un miroir fixe (0,29 mm de diamètre). Cette configuration raccourcit la longueur de la pointe distale rigide pour faciliter le passage vers l'avant de l'endomicroscope à travers un canal de travail standard (3,2 mm de diamètre) dans les endoscopes médicaux. Cette capacité permet une utilisation transparente en tant qu'accessoire lors d'une endoscopie de routine.

Emballage plié du chemin optique et de l'endomicroscope. (a) Le faisceau d'excitation sort du SMF et passe à travers l'ouverture centrale du scanner. Le faisceau se dilate et se réfléchit sur un miroir circulaire fixe vers le scanner pour les déviations latérales. L'optique de focalisation se compose d'une paire de doublets achromatiques et d'une lentille à immersion solide (demi-boule) qui assure le contact avec la surface muqueuse. ZEMAX 2013 (https://www.zemax.com/) a été utilisé pour la conception optique et la simulation de lancer de rayons. (b) L'arrangement d'emballage pour les composants individuels de l'instrument, y compris la fibre monomode (SMF), le scanner, le miroir et les lentilles, est illustré. Solidworks 2016 (https://www.solidworks.com/) a été utilisé pour la modélisation 3D de l'emballage de l'endomicroscope.

Un SMF avec un diamètre de champ de mode de 3, 5 μm à 488 nm (# 460HP, Thorlabs) a été utilisé pour servir de "trou d'épingle" pour filtrer spatialement la lumière hors foyer (Fig. 5b). Le SMF était enfermé dans un tube en polymère flexible (#Pebax 72D, Nordson MEDICAL). Une longueur d'environ 4 mètres a été utilisée pour fournir une distance suffisante entre le patient et le système d'imagerie. Une paire de doublets achromatiques revêtus de MgF2 de 2 mm de diamètre (# 65568, # 65567, Edmund Optics) et une lentille demi-boule non revêtue de 2 mm de diamètre (# 90858, Edmund Optics) ont été utilisés pour focaliser le faisceau et collecter la fluorescence. Un tube d'extrémité en acier inoxydable (longueur de 4 mm, OD de 2,0 mm, ID de 1,6 mm) a été inséré entre le polymère et les tubes extérieurs pour isoler le scanner des vibrations. Un adhésif de qualité médicale a été appliqué pour sceller l'instrument des fluides corporels et pendant le retraitement. Un tube thermorétractable a été utilisé pour protéger l'interface.

Un scanner compact a été fabriqué sur la base du principe de résonance paramétrique14. Une ouverture de 50 μm a été gravée au centre du réflecteur pour laisser passer le faisceau d'excitation. Le faisceau élargi a été dévié latéralement dans des directions orthogonales (plan XY) selon un motif de Lissajous à l'aide d'un ensemble d'actionneurs à peigne orthogonal. Une carte d'acquisition de données (#DAQ PCI-6115, NI) a été utilisée pour créer la forme d'onde analogique pour piloter le scanner. L'alimentation était fournie par des amplificateurs haute tension (#PDm200, PiezoDrive) via des fils électriques fins (#B4421241, MWS Wire Industries). Le câblage a été réalisé sur des ancres d'électrodes. Le scanner a été piloté à des fréquences proches de 15 kHz (axe rapide) et 4 kHz (axe lent) pour obtenir un FOV jusqu'à 250 μm × 250 μm. Les vidéos peuvent être collectées à des fréquences d'images de 10, 16 ou 20 Hz. Ces fréquences d'images ont été utilisées pour correspondre au taux de répétition du motif de balayage de Lissajous, qui dépend de la valeur des fréquences de commande X et Y du scanner29. Des détails sur les compromis entre la fréquence d'images, la résolution des pixels et la densité du motif de numérisation sont fournis dans nos travaux précédents14.

Un laser à semi-conducteurs (#OBIS 488 LS, Coherent) a délivré λex = 488 nm pour exciter la fluorescéine pour le contraste de l'image (Fig. 6a). La fibre amorce a été couplée à un bloc de filtre optique via un connecteur FC/APC (perte de 1,82 dB) (Fig. 6b). Le faisceau a été dévié par un miroir dichroïque (#WDM-12P-111-488/500:600, Oz Optics) dans le SMF via un autre connecteur FC/APC. La puissance incidente sur les tissus a été limitée à un maximum de 2 mW pour répondre aux exigences de la FDA en matière de risque non significatif selon 21 CFR 812. La fluorescence a traversé le miroir dichroïque et un filtre passe-long (#BLP01-488R, Semrock). Une fibre multimode d'environ 1 m de long avec un diamètre de noyau de 50 μm a été utilisée pour transmettre la fluorescence via un connecteur FC/PC au détecteur du tube photomultiplicateur (PMT) (#H7422-40, Hamamatsu). Le signal de fluorescence a été amplifié par un amplificateur de courant à grande vitesse (#59-179, Edmund Optics). Un logiciel personnalisé (LabVIEW 2021, NI) a été développé pour effectuer l'acquisition de données et le traitement d'images en temps réel. Les paramètres de puissance laser et de gain PMT ont été déterminés par un microcontrôleur (#Arduino UNO, Arduino) à l'aide d'une carte de circuit imprimé personnalisée. Le SMF et les fils étaient terminés par des connecteurs et insérés dans les ports fibre (F) et fil (W) de la station de base (Fig. 6c). Le système d'imagerie était contenu sur un chariot portable (Fig. 6d). Un transformateur d'isolement a été utilisé pour limiter le courant de fuite à <500 μA.

Système d'imagerie. (a) Le PMT, le laser et les amplificateurs sont contenus dans la station de base. (b) Dans le bloc de filtre, le laser (bleu) délivre une excitation via une queue de cochon à fibre via un connecteur FC/APC. Le faisceau est dévié par un miroir dichroïque (DM) dans une fibre monomode (SMF) via un second connecteur FC/APC. La fluorescence (verte) traverse le DM et un filtre passe-long (LPF) vers le PMT via une fibre multimode (MMF). (c) L'extrémité proximale de l'endomicroscope se connecte aux ports de fibre (F) et de fil (W) de la station de base. (d) L'endomicroscope, le moniteur, la station de base, l'ordinateur et le transformateur d'isolation sont contenus sur un chariot portable. (a, c) Solidworks 2016 a été utilisé pour la modélisation 3D de l'assemblage du système d'imagerie et de l'endomicroscope.

La résolution latérale et axiale de l'optique de focalisation a été mesurée à partir de la fonction d'étalement ponctuel de microsphères fluorescentes de 0, 1 μm de diamètre (# F8803, Thermo Fisher Scientific). Les images ont été collectées en déplaçant les microsphères dans les directions horizontale et verticale par incréments de 1 μm à l'aide d'une platine linéaire (# M-562-XYZ, DM-13, Newport). Les images ont été empilées à l'aide d'ImageJ2 pour obtenir des images en coupe transversale à partir des microsphères.

Un logiciel personnalisé (LabVIEW 2021, NI) a été développé pour effectuer l'acquisition de données et le traitement d'images en temps réel. Un aperçu des routines utilisées pour le fonctionnement du système est illustré à la Fig. 7. L'interface utilisateur se compose des panneaux d'acquisition de données (DAQ), principal et du contrôleur. Le panneau DAQ communique avec le panneau principal pour acquérir et enregistrer des données brutes, fournit une entrée pour les paramètres d'acquisition de données définis par l'utilisateur et contrôle les paramètres d'activation du scanner. Le panneau principal permet à l'utilisateur de sélectionner la configuration souhaitée pour utiliser l'endomicroscope, y compris les signaux de commande vers le scanner, la fréquence d'images vidéo et les paramètres d'acquisition de données. Ce panneau permet également aux utilisateurs d'afficher et de contrôler la luminosité et le contraste de l'image. En utilisant des données brutes comme entrée, un algorithme calcule le réglage de gain optimal pour le PMT et ajuste automatiquement ce paramètre à l'aide d'un système de contrôle de rétroaction basé sur le proportionnel-intégral (PI)16. Le panneau du contrôleur communique à la fois avec le panneau principal et le panneau DAQ pour contrôler la puissance du laser et le gain du PMT.

Architecture logicielle du système. L'interface utilisateur comprend des modules pour (1) l'acquisition de données (DAQ), (2) le panneau principal et (3) le panneau du contrôleur. Les programmes s'exécutent simultanément et communiquent entre eux via la file d'attente de messages. Légende – MEMS : systèmes microélectromécaniques, TDMS : flux de gestion de données techniques, PI : proportionnel-intégral, PMT : tube photomultiplicateur. Les fichiers image et vidéo sont enregistrés respectivement aux formats BMP et AVI.

Un algorithme de correction de phase a été utilisé pour calculer la variance des intensités des pixels de l'image à différentes valeurs de phase afin de déterminer la plus grande valeur pour affiner l'image15. Pour la correction en temps réel, la phase a été balayée sur une plage de ±2,86° avec une taille de pas relativement grande de 0,286° pour réduire le temps de calcul. De plus, une région partielle de l'image avec un plus petit nombre d'échantillons a été utilisée pour réduire davantage le temps de calcul de 7,5 s (1 M échantillons) à 1,88 s (250 K échantillons) par trame d'image à 10 Hz. Ces paramètres d'entrée ont été choisis pour fournir une qualité d'image suffisante avec un délai minimal lors de l'imagerie in vivo. Les images et les vidéos en temps réel sont enregistrées respectivement aux formats BMP et AVI. Les données brutes ont été enregistrées au format TMDS (Technical Data Management Streaming).

Les images in vivo ont été post-traitées pour améliorer la qualité à l'aide de LabVIEW 2021. L'algorithme de correction de phase avait une précision limitée lorsqu'il était utilisé pendant l'imagerie in vivo en raison des longs temps de calcul requis. Seuls une zone d'image et un nombre d'échantillons limités ont été utilisés. De plus, l'algorithme était moins efficace pour les images avec un artéfact de mouvement ou un faible contraste, et conduisait à des erreurs de calcul de phase30. Des images individuelles avec un contraste élevé et sans artefact de mouvement ont été sélectionnées manuellement pour affiner la phase avec une plage de balayage de phase de ± 0,75 ° et une taille de pas de 0,01 °. La zone d'image complète (par exemple, 1 M d'échantillons pour les images enregistrées à 10 Hz) a été utilisée. Les détails sur les paramètres d'image utilisés pour le temps réel et le post-traitement sont résumés dans le tableau S2. Après correction de phase, le bruit de l'image a été encore réduit à l'aide d'un filtre médian. La luminosité et le contraste ont été encore améliorés grâce à l'étirement de l'histogramme et à la correction gamma31.

L'étude clinique a été approuvée par le comité d'examen institutionnel de Michigan Medicine et a été réalisée dans l'unité des procédures médicales. L'étude a été enregistrée en ligne sur ClinicalTrials.gov (NCT03220711, date d'enregistrement : 18/07/2017). Les critères d'inclusion incluaient les patients (âgés de 18 ans à 100 ans) devant subir une coloscopie de routine, présentant un risque accru de cancer colorectal et ayant des antécédents de maladie inflammatoire de l'intestin. Le consentement éclairé a été obtenu de chaque sujet qui a accepté de participer. Les critères d'exclusion incluaient les patientes enceintes, allergiques connues à la fluorescéine ou sous chimiothérapie active ou radiothérapie. Des patients consécutifs programmés pour une coloscopie de routine ont été recrutés pour cette étude et représentaient la population vue à Michigan Medicine. L'étude a été réalisée conformément à la Déclaration d'Helsinki.

Avant la procédure, l'endomicroscope a été calibré à l'aide de billes fluorescentes de 10 μm de diamètre (#F8836, Thermo Fisher Scientific) fixées dans un moule en silicone. Un mastic silicone translucide (#RTV108, Momentive) a été coulé dans un moule en plastique imprimé en 3D de 8 cm3. Des billes fluorescentes aqueuses ont été déposées sur le silicone et laissées jusqu'à ce que le milieu aqueux sèche.

Un coloscope médical standard (Olympus, CF-HQ190L) a été utilisé pour examiner l'ensemble du côlon en utilisant un éclairage à lumière blanche. Une fois que l'endoscopiste a identifié une région suspecte de maladie, le site a été rincé avec 5 à 10 ml d'acide acétique à 5 % suivi d'eau stérile pour éliminer le mucus et les débris. Une dose de 5 ml de fluorescéine à 5 mg/ml (Alcon, Fluorescite) a été injectée par voie intraveineuse ou pulvérisée localement sur la muqueuse à l'aide d'une canule standard (M00530860, Boston Scientific) passée à travers le canal de travail.

Un irrigateur a été utilisé pour laver tout excès de colorant ou de débris sur la surface de la muqueuse. Le cathéter de pulvérisation a été retiré, et l'endomicroscope a ensuite été passé à travers le canal de travail pour collecter des images in vivo. La pointe distale a été positionnée sur la région cible à l'aide d'une endoscopie à champ large pour le guidage. Le temps total utilisé pour collecter les images confocales était <10 min. Les vidéos d'endoscopie en lumière blanche ont été traitées avec le système d'imagerie Olympus EVIS EXERA III (CLV-190) et enregistrées à l'aide d'un enregistreur vidéo Elgato HD. Les vidéos d'endomicroscopie ont été enregistrées et sauvegardées à l'aide de LabVIEW 2021. Une fois l'imagerie terminée, l'endomicroscope a été retiré et une pince à biopsie ou un piège a été utilisé pour réséquer les tissus imagés. Les tissus ont été traités pour l'histologie de routine (H&E) et évalués par un pathologiste gastro-intestinal expert (HDA). Les propriétés spectrales de la fluorescéine ont été confirmées à l'aide d'un spectromètre (USB2000+, Ocean Optics) comme le montre la Fig. S2.

Les endomicroscopes ont été stérilisés après chaque utilisation chez des sujets humains (Fig. 8). La procédure de nettoyage a été effectuée sous la direction et avec l'approbation du Département de contrôle des infections et d'épidémiologie et du Département central de retraitement stérile de Michigan Medicine. Avant l'étude, les instruments ont été testés et validés pour la stérilisation par Advanced Sterilization Products (ASP, Johnson & Johnson), une entité commerciale qui fournit des services de prévention des infections et de validation de la stérilisation.

Retraitement des instruments. (a) L'endomicroscope a été placé dans un plateau après chaque procédure de stérilisation avec le processus de retraitement STERRAD. (b) Le SMF et les fils ont été terminés avec des connecteurs de fibre et électriques, respectivement, qui ont été coiffés avant le retraitement.

L'endomicroscope a été retraité en suivant les étapes suivantes : (1) L'endomicroscope a été essuyé de l'extrémité proximale à l'extrémité distale avec un chiffon non pelucheux imbibé de détergent enzymatique ; (2) L'instrument a été immergé dans une solution de détergent enzymatique pendant 3 min, rincé à l'eau et séché avec un chiffon non pelucheux. Les connecteurs électriques et de fibre ont été recouverts et laissés en dehors de la solution ; (3) L'endomicroscope a été enveloppé et placé dans un plateau d'instruments pour la stérilisation à l'aide de STERRAD 100NX, un système de retraitement qui utilise la technologie du plasma gazeux au peroxyde d'hydrogène à une température relativement basse et dans un environnement à faible humidité pour un cycle standard de 47 min.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Les auteurs reconnaissent le soutien financier du Beijing Institute of Collaborative Innovation (BICI), du Michigan Translational Research and Commercialization (MTRAC) pour les sciences de la vie et de Maiqi Technology Ltd (TDW). Nous remercions HD Appelman, JM Abraham, S. Bishu, JA Kinnucan, R. Kuick, RS Kwon, RJ Law, NM Sheth, E. Stoffel, MB Sturm, MS Takami, EJ Wamsteker, BR Manoogian, JD Machicado, JA Berinstein, E. Brady, S. Jaiswal, C. Nolan et L. Sitka pour le support technique.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Miki Lee et Gaoming Li.

Département de médecine interne, Université du Michigan, Ann Arbor, 48109, États-Unis

Miki Lee, Gaoming Li, Haijun Li, Xiyu Duan, Danielle K. Turgeon et Thomas D. Wang

Département de génie mécanique, Université du Michigan, Ann Arbor, 48109, États-Unis

Maire B. Birla, Tse-Shao Chang, Kenn R. Oldham et Thomas D. Wang

Département de génie biomédical, Université du Michigan, Ann Arbor, 48109, États-Unis

Thomas D. Wang

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ML, GL, HL, XD, MBB, KRO et TDW ont conçu la technologie. ML, DKT et TDW ont conçu et conçu les expériences. ML, XD, GL, TS.C. et DKT ont réalisé les expériences. ML et TDW ont contribué à l'analyse des images et des données et ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Thomas D. Wang.

GL, XD, MB, HL, KO et TDW sont les inventeurs de brevets déposés par l'Université du Michigan sur la technologie présentée : (1) KRO, TDW, MB, XD Phase Detection and Correction using Image-Based Processing, CN113015881A, 22 Juin 2021. (2) TDW, HL, XD, GL Endomicroscope confocal ultra-compact à faisceau plié, WO2020191075A1, 24 septembre 2020. (3) TDW, XD, GL, HL Ultra-Compact Microsystems-Based Single Axis Confocal Endomicroscope, WO2020191083A1, 24 septembre 2020. (4) KRO, TDW, MB, XD Phase Detection and Correction using Image-Based Processing, WO2020087015A1, 30 avril 2020. ML, TS.C. et DKT ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Lee, M., Li, G., Li, H. et al. Endomicroscope laser confocal avec scanner MEMS distal pour l'histopathologie en temps réel. Sci Rep 12, 20155 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24210-9

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Reçu : 26 juillet 2022

Accepté : 11 novembre 2022

Publié: 23 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-24210-9

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