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Jun 14, 2023

Utilisation du sous-marin d'imagerie de speckle

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 2613 (2023) Citer cet article

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La croissance de la colonie microbienne est entraînée par l'activité des cellules situées sur les bords de la colonie. Cependant, ce processus n'est pas visible à moins qu'une coloration ou une coupe transversale spécifique de la colonie ne soit effectuée. La technologie d'imagerie Speckle est une méthode non invasive qui permet de visualiser les zones d'activité microbienne accrue au sein de la colonie. Dans cette étude, la technique d'imagerie laser speckle a été utilisée pour enregistrer la croissance des colonies microbiennes. Cette méthode a été testée sur trois microorganismes différents : Vibrio natriegens, Escherichia coli et Staphylococcus aureus. Les résultats ont montré que le système d'analyse de speckle est non seulement capable d'enregistrer la croissance de la colonie microbienne mais aussi de visualiser l'activité de croissance microbienne dans différentes parties de la colonie. La technique d'imagerie de speckle développée visualise la zone de "l'activité microbienne la plus élevée" migrant du centre vers la périphérie de la colonie. Les résultats confirment l'exactitude des modèles précédents de croissance des colonies et fournissent des algorithmes pour l'analyse de l'activité microbienne au sein de la colonie.

La croissance de la taille des colonies est utilisée comme critère de caractérisation de l'activité microbienne sur milieu gélosé. La croissance de la taille des colonies est généralement surveillée en enregistrant des images en direct à différents moments et en comparant les tailles des colonies. En adoptant cette technique d'imagerie, les images sont obtenues par des caméras haute résolution ou des scanners à plat1,2. Le temps de détection critique, la taille des colonies, le taux de croissance et la taille maximale des colonies sont les paramètres qui peuvent être quantifiés à l'aide des méthodes d'imagerie en direct existantes.

Il existe plusieurs modèles décrivant la croissance des colonies3,4,5. Dans de nombreux modèles, la croissance des colonies microbiennes est décrite comme étant inégale - la croissance des colonies dépend des zones actives des microbes qui, à leur tour, dépendent de l'apport en nutriments du milieu. Par exemple, la croissance microbienne sur le bord de la colonie est plus active qu'en son centre en raison de l'apport constant de nutriments provenant des milieux environnants ou de la poussée constante des cellules sur les latérales. La structure microscopique de la colonie soutient nombre de ces présomptions. Les cellules au centre de la colonie de levure cessent de proliférer et perdent leur viabilité tandis que les cellules situées en périphérie de la même colonie sont vivantes et continuent de croître (prolifèrent)6. Les différences d'activité microbienne dans différentes parties de la colonie ne peuvent pas être visualisées avec précision avec les méthodes d'imagerie en direct existantes. Actuellement, différentes activités microbiennes au sein des colonies ne peuvent être explorées qu'avec des procédures invasives - coupe transversale des colonies et coloration de la viabilité6.

Un motif d'interférence créé par la lumière cohérente réfléchie ou diffusée à partir de différentes parties de la surface éclairée est un chatoiement laser. Si un objet qui est irradié avec des mouchetures laser ne change pas les propriétés de diffusion au fil du temps, l'image de mouchetures ne changera pas non plus. Si les diffuseurs se déplacent spontanément (par exemple, mouvement brownien), certaines mouchetures commencent à changer (forme, intensité). La modification des propriétés de diffusion des objets crée un chatoiement variant dans le temps. C'est-à-dire que des événements ou des influences externes, ainsi que des processus se produisant directement sur la surface mesurée, peuvent entraîner des changements dans les images de speckle7. En ce qui concerne ce phénomène, la technique d'imagerie laser speckle s'est avérée utile pour surveiller l'activité microbienne dans des milieux optiquement inhomogènes en analysant des motifs de speckle laser variant dans le temps.

La technique d'imagerie laser speckle est une technologie émergente pour les analyses médicales et de sécurité alimentaire. Il permet la détection précoce de la croissance microbienne8, l'identification d'une infection fongique dans les pommes9 et la mesure du débit sanguin périphérique chez les patients atteints de sclérose10.

Dans cette étude, la technique d'imagerie speckle a été utilisée pour enregistrer la croissance et les caractéristiques structurelles de la colonie microbienne. Les résultats ont montré que le système d'analyse de speckle développé est capable non seulement d'enregistrer la croissance d'une colonie microbienne mais aussi de visualiser l'activité de croissance microbienne dans les différentes parties de la colonie. L'imagerie speckle révèle que la croissance des colonies est entraînée par la prolifération cellulaire sur ses bords plutôt que son centre. Les résultats confirment l'exactitude des modèles précédents de croissance des colonies et fournissent des algorithmes pour les analyses d'activité microbienne au sein de la colonie.

Les souches microbiennes suivantes ont été utilisées dans les expériences : Escherichia coli ATCC® 8739 (E. coli), Vibrio natriegens DSM 759 (V. natriegens) et Staphylococcus aureus ATCC® 6538P (S. aureus). Les cultures bactériennes ont été maintenues sur des plaques de gélose. E. coli et S. aureus ont été maintenus sur des milieux de gélose LB constitués de Bacto Peptone 10 g/l, d'extrait de levure 5 g/l, d'agar 20 g/l (tous Biolife, Italie) et de NaCl 5 g/l (Sigma, Allemagne). V. natriegens a été maintenu à température ambiante sur un bouillon salé NB gélosé : Difco Nutrient Broth 8 g/l, NaCl 15 g/l, comme suggéré par Weinstock et al.11.

Toutes les espèces microbiennes ont été sous-cultivées à partir d'une seule colonie dans les milieux liquides respectifs et cultivées à + 30 ° C pendant la nuit. Des boîtes de Pétri ont été inoculées avec une culture bactérienne diluée en série pour donner 20 à 200 colonies par boîte. Des boîtes de Pétri avec des bactéries inoculées ont été placées à + 30 ° C dans un incubateur (Herracell 240-i, Thermo Scientific). La croissance des colonies a été surveillée en parallèle par un éclairage laser à 635 nm (voir la description dans "Système expérimental pour capturer les images de speckle laser et les images sous éclairage à large bande") et par un scanner de documents à plat (CanoScan 4400f, Canon). La numérisation automatisée des plaques après chaque intervalle de 15 ou 30 minutes a été assurée en exécutant l'application Auto Clicker. La résolution des images était de 600 DPI.

Le système expérimental d'imagerie laser speckle a été assemblé pour capturer des images à l'échelle macro sous une lumière LED blanche et un éclairage laser rouge. Le système se compose d'une source laser multimode, d'une source de lumière LED blanche, d'un objectif à monture C de 35 mm @F18, d'un atténuateur optique, d'une plaque de gélose de test (avec des bactéries inoculées) et d'une caméra CMOS (Fig. 1). Les taches laser ont été générées par un laser à semi-conducteur pompé par diode multimode 635 nm à polarisation linéaire (puissance de sortie jusqu'à 300 mW) avec une longueur de cohérence de 30 cm. L'atténuateur optique a été utilisé pour obtenir l'exposition optimale pour la capture d'image et pour éviter les effets de chauffage de la plaque éclairée, permettant une densité de puissance de 3 à 5 mW/cm2 de la lumière laser diffusée sur toute la surface de la plaque de gélose. Le diamètre du faisceau laser sur la surface était supérieur à 9 cm, fournissant un éclairage uniforme de toute la plaque de Pétri standard. Les principaux composants du système sont présentés sur la Fig. 1. Les images de speckle ont été capturées par une caméra CMOS à des intervalles de 30 s pour des expériences de différentes durées (25 à 70 h). Le temps d'exposition a été fixé à 1 s ; il a été choisi en fonction de l'éclairage laser et du diaphragme de l'objectif. Les paramètres de la configuration optique, y compris la résolution de la caméra, le diaphragme de l'objectif, la distance de la caméra à la plaque de Pétri et la région d'intérêt résultante, ont été choisis pour obtenir une résolution spatiale adéquate pour la détection des taches laser. Le grossissement de la lentille a été fixé à 0,2. La valeur de diaphragme de F18 a été choisie comme l'équilibre optimal entre la netteté de l'image, la taille des taches et l'exposition requise. Cela résulte d'une résolution spatiale de 9 μm et d'une taille de speckle de 33 μm.

Flux de travail expérimental pour la capture d'images de speckle pendant la croissance des bactéries. (A) Inoculation d'une colonie unique dans un milieu LB et culture d'une nuit (+ 30 oC). (B) Dilution et inoculation d'une culture d'une nuit sur un milieu LB gélosé. (C) Croissance de colonies sur des plaques d'agar à thermostat + 30 ° C avec capture d'image de tache sous un laser de 635 nm et un scanner à plat. D Traitement d'images et analyse de données (environnement MATLAB) : détection de la taille des colonies, de la vitesse de croissance, filtration du signal de speckle, identification de la migration du speckle, etc.

Dans les études précédentes, les auteurs ont décrit une analyse sensible des sous-pixels de corrélation, qui peut aider à détecter l'activité bactérienne et ses effets au sein d'une colonie8,12. L'ensemble du champ de l'expérience (boîte de Pétri) a été divisé en petites sections de N × N pixels. Les étapes ci-dessous ont été réalisées pour chaque section séparément. Une intercorrélation normalisée bidimensionnelle a été effectuée entre des images consécutives de N × N pixels du début à la fin de l'expérience13 :

où a(x,y) et b(x,y) sont deux trames adjacentes dans la séquence, \(\overline{a}\) et \(\overline{b}\) sont les valeurs moyennes de ces deux trames, u et v sont les déplacements spatiaux entre les repères a(x,y) et b(x,y) vers x et y, respectivement.

Il était nécessaire de trouver le décalage exact du pic de corrélation croisée. Cette valeur caractérise les changements qui se produisent entre des images NxN pixels consécutives :

Pour trouver une valeur plus précise du décalage, l'interpolation parabolique a été effectuée autour du pic de la fonction d'intercorrélation14 :

où \({a}_{u}\) et \({b}_{u}\) sont les coefficients paraboliques.

Les décalages obtenus entre chaque couple d'images adjacentes de NxN pixels ont été cumulés du début à la fin de l'expérience :

L'exécution de l'algorithme décrit pour des images N × N pixels consécutives pour toute la séquence crée un "signal temporel".

Cet algorithme a été mis en œuvre pour toutes les sections de pixels N × N dans tout le champ de l'expérience. Ainsi, un tableau bidimensionnel à partir des "signaux temporels", où le temps est la troisième dimension, a été obtenu à la place du champ considéré de l'expérience.

Pour trouver les extrema locaux et éviter l'influence des pointes transitoires locales, il convient de lisser le signal15. La fonction d'enveloppe du signal a été utilisée (Fig. 2). Une technique de racine carrée mobile ou un autre algorithme similaire peut être utilisé à cette fin :

où N est la longueur de la fenêtre, n est l'échantillon courant, k est l'index courant à l'intérieur de la fenêtre. En conséquence, N - la longueur de la fenêtre - est responsable du degré de lissage du signal. Pour éviter les valeurs aberrantes lors de l'exécution de la technique RMS, les valeurs extrêmes peuvent être tronquées, comme cela se fait en adoptant la technique de la moyenne tronquée16.

En haut à gauche : Le signal obtenu à l'aide de l'algorithme (bleu) et son enveloppe (rouge). (Signal du centre de la colonie). La ligne verte indique le moment de l'activité maximale. La figure montre un signal provenant d'une colonie de S. aureus. Un motif de signal de chatoiement similaire a également été observé pour E. coli et V. natriegens. En bas à gauche : Un spectrogramme est une représentation d'un signal sur un domaine temps-fréquence à l'aide d'une transformée de Fourier à court terme (STFT), permettant d'observer simultanément le comportement du signal et du bruit en temps et en fréquence. Côté droit : le bruit (hors de la colonie) obtenu à l'aide de l'algorithme (en haut) et du spectrogramme de bruit (en bas).

Sur la Fig. 2, il est également possible de comparer le signal (à l'intérieur de la colonie) et le bruit (à l'extérieur de la colonie) à la fois dans les domaines temporel et fréquentiel. Le signal est beaucoup plus élevé que le niveau de bruit.

Tout d'abord, il a été testé si le système d'imagerie laser speckle établi n'affectait pas la croissance des colonies microbiennes. Pour vérifier cela, le rayon de croissance des colonies estimé par le système de speckle laser a été comparé aux résultats obtenus à l'aide de la méthode de référence - un système d'imagerie par scanner à plat bien reconnu. À cette fin, les micro-organismes ont été sous-cultivés à partir d'une seule colonie pendant la nuit, dilués en série, puis soit inoculés sur une boîte de Pétri pour observer les formations de colonies à partir d'une seule cellule (environ 20 à 200 colonies par boîte) ou en appliquant des taches de dilutions en série sur le plaques et ainsi obtenir des macrocolonies. Des micro et macro colonies sur milieu gélosé ont été cultivées dans le même incubateur en parallèle sous un système d'imagerie speckle et sur le scanner à plat (Canon Canoscan4400r). La croissance des colonies de V. Natriegens, E. coli et S. aureus a été enregistrée et leurs motifs de chatoiement ont été analysés à l'aide d'un algorithme de corrélation de sous-pixels (décrit dans "Algorithme de la conversion d'image de chatoiement en signaux temporels"). Les résultats sont présentés dans la Fig. 3.

Dynamique du rayon de croissance des colonies dans le temps. Les rayons des colonies d'E. coli, V. natriegens et S. aureus ont été mesurés par analyse d'image laser speckle (bleu) ou en considérant des images prises par un scanner à plat (Canon 4400, 600 DPI) (rouge).

En comparant la croissance des colonies testées, des résultats très similaires ont été obtenus avec les deux systèmes. Par conséquent, on peut conclure que le système de chatoiement laser établi n'affecte pas la croissance des colonies microbiennes (voir Fig. 3). Nous avons comparé le taux de croissance radiale des colonies microbiennes cultivées sous un appareil d'imagerie speckle et dans un scanner à plat et le taux de croissance radiale ne différait pas de manière significative (test t, p > 0,05), voir le tableau supplémentaire 1.

De plus, il a été analysé si le signal de speckle de la colonie en croissance est en corrélation avec le nombre de cellules dans la colonie. Le temps de la valeur maximale du signal des images de speckle laser a été comparé au nombre initial de cellules dans la macrocolonie (voir Fig. 4). Le moment de la valeur maximale du signal est défini comme le moment où l'activité du signal atteint son maximum. La culture d'E. coli pendant la nuit a été diluée en série et inoculée sur le milieu de gélose LB sous forme de macrocolonies (le volume de chaque inoculum était de 5 μL). La croissance de la macrocolonie a été enregistrée à l'aide d'un système d'imagerie laser speckle. Le moment de la valeur maximale du signal pour chaque macrocolonie a été déterminé et tracé par rapport au nombre initial de cellules par macrocolonie. Les valeurs moyennes des temps de pointe du signal et l'écart type des trois séries d'inoculation indépendantes ont été calculés (voir Fig. 4).

Dépendance du temps de la valeur maximale du signal (lignes rouges sur le graphique à gauche et cercles bleus sur le graphique à droite) obtenue par le système d'imagerie laser sur le nombre initial de cellules E. coli dans la colonie.

Les premiers résultats ont démontré que la croissance des colonies dans un système d'imagerie de speckle était la même que dans un scanner à plat. De légères différences entre eux proviennent de la croissance individuelle de la colonie, qui peut être affectée par la localisation de la colonie dans la plaque ou la distance aux voisins les plus proches17. Pendant ce temps, le temps de la valeur maximale du signal du signal de speckle dépend du nombre initial de cellules dans la colonie. Si le nombre initial de cellules dans la colonie est important, il faut moins de temps pour atteindre le signal de chatoiement maximal. D'autre part, si le nombre initial de cellules est petit, il faudra plus de temps pour atteindre la valeur maximale du signal de speckle. Même si la croissance des colonies se poursuit pendant plus de 20 h (voir Fig. 4 pour E. coli), le maximum du signal de speckle est atteint une fois et il ne "récupère" jamais.

Le signal obtenu par corrélation sub-pixel des images de speckle laser, qui caractérise l'activité bactérienne, augmente à l'intérieur de la colonie, atteint son maximum, puis diminue. La force du signal avait une distribution spatio-temporelle remarquable. Différentes parties de la colonie avaient des temps de pointe de signal maximaux différents. Le pic d'activité maximum a été initialement observé au centre de la colonie. Au fil du temps, la "vague" d'activité a migré du centre vers les bords de la colonie (voir les figures 5 et 6). Ce comportement spatio-temporel du signal de speckle a été observé au sein de toutes les colonies microbiennes testées : S. aureus, E. coli et V. natriegens. Même si des analyses approfondies sur la structure de la migration du signal de speckle ont été effectuées sur plusieurs colonies de trois espèces microbiennes différentes (V. natriegens, E. coli et S. aureus), la migration du signal du centre vers le bord de la colonie est caractéristique de chaque colonie microbienne. Dans la Fig. supplémentaire, S1 montre un exemple d'une partie d'une boîte de Pétri avec environ 25 à 30 colonies. Chacune des colonies après analyse de corrélation de sous-pixel montre la formation de l'effet d'anneau d'activité décrit ci-dessus.

Distribution spatio-temporelle du signal de speckle dans la colonie de S. aureus. Rangée supérieure : dynamique du signal dans le temps à différents points de la colonie (étoile blanche dans les graphiques du milieu). La ligne verte marque l'activité maximale, après quoi le signal diminue. Rangée du milieu : évolution de l'activité au cours de la croissance de la colonie. Rangée du bas : images brutes de speckle.

Le moment du pic d'activité de la colonie (le début de la diminution de l'activité) pendant la croissance de la colonie de S. aureus. Image du haut : une image spatio-temporelle bidimensionnelle ; image du bas - l'activité maximale en fonction du temps. Un comportement spatio-temporel similaire du signal a également été observé dans les colonies d'E. coli et de V. natriegens.

Il est possible d'obtenir une image illustrant le début de la décroissance de l'activité dans toute la colonie (voir Fig. 6, image du haut) en choisissant les instants du début de la décroissance sur toute la surface de la colonie et en les plaçant sur un carte spatiale bidimensionnelle avec les coordonnées correspondantes.

L'"anneau" de haute activité se forme autour du centre, puis il migre avec le devant de la colonie en croissance. La couleur indique le moment (en heures) auquel l'activité a commencé à diminuer : la couleur bleue (au centre) représente le plus tôt, la couleur rouge représente le plus tardif (bord de la colonie).

L'emplacement de la première diminution sur la carte peut être considéré comme le point de départ de la croissance d'une colonie microbienne. Connaissant les coordonnées de ce point de départ ou centre, il est possible d'obtenir une courbe de la croissance de la colonie en fonction du temps. Cependant, comme la croissance de la colonie dépend de divers facteurs (disponibilité en oxygène et en nutriments, mouvement brownien, poussée et/ou traction des cellules voisines au sein de la colonie, asynchronie de la croissance et de la prolifération cellulaire au sein de la colonie, etc.) la courbe résultante aura une certaine dispersion de valeurs (Fig. 6, graphique du bas). Par conséquent, un filtre médian mobile a été appliqué pour lisser les données de courbe15 :

où N est la longueur de la fenêtre, n est l'échantillon actuel. La médiane est le nombre qui se situe au milieu d'un ensemble de nombres lorsqu'il est trié par ordre croissant. Autrement dit, la moitié des éléments de l'ensemble de nombres ne sont pas inférieurs à la médiane et l'autre moitié n'est pas supérieure à la médiane :

Cette méthode a été appliquée pour les raisons suivantes : (1) Elle ne cherche pas à ajuster la courbe dans une forme spécifique : une droite, ou une parabole, etc. (2) Contrairement à une moyenne mobile, elle ne prend pas en compte les valeurs aberrantes .

L'effet "anneau" a été obtenu pour les trois types de bactéries testées. Le taux de croissance était la principale différence observée (Fig. 7).

Courbes d'activité maximale des colonies en fonction du temps pour 3 à 4 colonies de V. natriegens (bleu), E. coli (rouge) et S. aureus (vert).

En prenant les points correspondant à la distance du centre de la colonie selon la courbe décrite dans les Figs. 6 et 7, les coordonnées dans l'espace (x, y) pour chaque "anneau" sont obtenues. Une fonction d'enveloppe lissée du signal est placée à chacun de ces points dans l'espace (Fig. 5). Ainsi, de nombreux signaux correspondront à chaque rayon spécifique (la distance entre le centre de la colonie et le point d'activité maximale). Dans une situation idéale, tous les signaux dans le même "anneau" (à la même distance du centre de la colonie) seraient les mêmes. Cependant, la croissance d'une colonie bactérienne est affectée par diverses conditions mentionnées ci-dessus, de sorte que ces signaux sont légèrement différents. Par conséquent, il est nécessaire de faire une moyenne de tous les signaux pour un rayon donné, de sorte que chaque rayon reçoive un signal qui le caractérise. Un tel moyennage a été effectué en adoptant la méthode de la moyenne tronquée16, où la troncature a été effectuée non pas en amplitude, mais dans le temps du pic d'activité :

où L est le nombre de signaux d'enveloppe à une distance donnée, \({k}_{b}\) et \({k}_{f}\)—le nombre de signaux d'enveloppe qui ont été tronqués de chaque côté. C'est-à-dire que les signaux dont le pic d'activité dans le rayon donné était très différent de la tendance générale (prématuré ou retardé) n'ont pas été pris en compte. Les signaux moyennés obtenus ont été cartographiés en fonction de la distance par rapport au centre et du temps (Fig. 8, image du haut).

Enveloppes des signaux moyennés en fonction de la distance du centre de la colonie et du temps (en haut) et du pic d'activité en fonction de la distance du centre de la colonie à différents moments (en bas) de S. aureus. Un comportement spatio-temporel similaire du signal a également été observé dans les colonies d'E. coli et de V. natriegens.

En sélectionnant plusieurs points dans le temps sur la carte, il est possible d'observer à quoi ressemblera le pic d'activité en fonction de la distance au centre de la colonie. La largeur du pic est proportionnelle à la largeur de "l'anneau" d'activité, et son évolution dans le temps est indiquée dans le graphique du bas de la Fig. 8.

La largeur spatiale du signal à différents moments peut être observée sur la figure 8. La largeur du signal correspond à la diminution de la valeur de crête à une certaine valeur. S'il n'y avait pas de bruit, de signaux indésirables ou de tout autre facteur, le critère serait simple : réduire le niveau du signal ou sa puissance de la valeur maximale à zéro. Cependant, dans des conditions réelles, il devrait y avoir un certain seuil lorsque le signal se distingue encore du bruit. La diminution de la puissance du signal du maximum à 1/3 de la valeur maximum a été choisie comme critère. Autrement dit, il convient de noter que la largeur réelle est légèrement supérieure à celle reçue. Il est possible de trouver la largeur pour chaque instant. Cette largeur correspondra à la largeur de "l'anneau" au moment correspondant (voir Fig. 9).

Détermination de la largeur de l'« anneau » d'activité pour la colonie de S. aureus : (a) valeurs du signal et largeur déterminée de l'anneau d'activité (ligne violette), (b) largeur obtenue de l'« anneau » d'activité, (c ) comparaison de la largeur obtenue de l'activité "anneau" (lignes noires) pour une colonie à différents moments. Un comportement spatio-temporel similaire du signal a également été observé dans les colonies d'E. coli et de V. natriegens.

D'après les figures 9a, b, on peut observer que bien que le changement de largeur de l'anneau soit faible, il peut être considéré comme constant avec quelques écarts. C'est-à-dire qu'à partir du moment où il a été possible de commencer à observer "l'anneau" et jusqu'à la fin de l'observation, lorsque "l'anneau" a disparu, la largeur de "l'anneau" est restée à peu près inchangée (avec des réserves sur la précision de la mesure , phénomènes aléatoires dans le comportement d'une colonie de nombreux micro-organismes, bruit, etc.). Le comportement décrit pour une colonie sélectionnée a été observé pour tous les types de bactéries considérés dans cette étude. La largeur de "l'anneau" est différente pour chaque type de bactérie. La figure 10 montre la largeur de "l'anneau" pour tous les types de colonies bactériennes. Les résultats obtenus correspondent au modèle mathématique de la croissance des colonies microbiennes introduit par John Pirt (« Pirt model »)5.

La largeur d'activité « anneau » en fonction du temps pour différentes colonies bactériennes ; (a) la largeur de "l'anneau" d'activité déterminée par la méthode du chatoiement ; (b) largeur "anneau" calculée en utilisant le modèle Pirt (Eq. 9). Les paramètres : alpha et r pour le modèle sont également obtenus à partir d'expériences de speckle. Chaque courbe montre la largeur de l'activité "anneau" au fil du temps de la colonie d'un type de bactérie spécifique.

L'étude de Pirt5 propose une formule de calcul de la largeur de la zone active ou "anneau" :

où ω est la largeur de la zone de prolifération cellulaire active de la colonie, r est le rayon de la colonie au temps t, et \({r}_{0}\) est le rayon à t = 0 ; α est le taux de croissance spécifique également appelé (μ, h−1), qui peut être trouvé à partir de l'équation de Gompertz8,17. Ainsi, disposant des données expérimentales (le rayon de la croissance de la colonie, le temps correspondant, et μ), il est possible de calculer la largeur de la zone active ou la largeur de "l'anneau" à l'aide de l'Eq. (9). Les résultats obtenus dans cette étude et le modèle de Pirt sont comparés dans la Fig. 10.

Le modèle global de la largeur de l'anneau est unique et uniforme pour chaque espèce bactérienne. Cependant, la dynamique de la largeur des anneaux d'activité de chaque colonie d'une espèce microbienne peut être décalée dans le temps. Pour les colonies à croissance plus longue, la prolifération et donc l'activité de speckle de la colonie conserve son activité plus longtemps. On peut supposer que cela est lié à la répartition des colonies sur la plaque. Étant donné que les colonies bactériennes sur les plaques de gélose étaient distribuées au hasard, leur croissance était affectée par les colonies microbiennes voisines. La croissance des colonies microbiennes est fortement affectée par les colonies voisines à proximité, de sorte que plus une colonie donnée a de colonies proches, plus sa croissance cesse tôt en raison de l'épuisement des ressources nutritionnelles communes des milieux18,19.

Le modèle de Pirt prédit que le bord en croissance active de la colonie microbienne pourrait être d'une largeur similaire à celle mesurée par l'activité de speckle (comparer Fig. 10. V. natriegens a et b), alors qu'il surestime la largeur du bord actif de la colonie microbienne dans le cas de E. coli et S. aureus. On peut sous-entendre que les différences proviennent du fait que le taux de croissance α, h−1 dans l'équation de Pirt est une constante, alors qu'en fait il change (diminue) au cours de la croissance de la colonie4. Un autre aspect à considérer est que dans les deux cas, des données expérimentales ont été utilisées pour les calculs. Cependant, comme mentionné ci-dessus, le bruit a influencé la précision des mesures.

La croissance de colonies microbiennes sur milieu gélosé est une technique utilisée en microbiologie dans la recherche et les tests de routine pour analyser la contamination microbienne d'échantillons environnementaux, alimentaires ou médicaux. De nombreux modèles mathématiques sont utilisés pour décrire la croissance des colonies microbiennes4,5,18,20. La largeur de la zone d'activité la plus éloignée - "l'anneau" de la colonie - est souvent incluse dans les modèles mathématiques pour simplifier (linéariser) le calcul de la dynamique de croissance de la colonie5,21. Cependant, les données expérimentales sur la taille réelle de la zone d'activité de la colonie en croissance sont rares.

Le modèle de Pirt de croissance des colonies microbiennes est parmi les premiers décrivant la croissance radiale des colonies microbiennes au fil du temps. Le modèle s'aligne bien avec les observations réelles s'il n'y a pas d'inhibition de croissance par les colonies voisines et si la taille de la zone d'activité en bordure est constante. Le modèle de Pirt a été validé sur les macrocolonies à croissance distante issues de nombreuses cellules5. Cependant, dans les tests de routine d'échantillons environnementaux ou médicaux, des microcolonies se développant à une distance aléatoire des colonies voisines sont généralement observées22. De plus, en raison de la composition génomique ou physiologique des espèces microbiennes, leurs colonies se développent sous différentes formes 3D (en forme de dôme, à plat, etc.), ce qui pourrait à son tour influencer la largeur de la zone d'activité en bordure de la colonie23 .

Dans l'un des modèles récents proposés par Warren et al.24, l'orientation des cellules microbiennes (horizontale ou verticale) ainsi que l'épuisement progressif des nutriments autour de la colonie définissent la dynamique de la croissance de la colonie. Warren et ses collègues dans leurs simulations ont remarqué la formation d'une structure "en anneau" métaboliquement active autour de la colonie, qui est formée par des cellules en contact direct avec le substrat, et où la plupart des activités de prolifération ont lieu24.

Dans cette (notre) étude, un système basé sur le chatoiement laser a été développé pour enregistrer la croissance des colonies microbiennes avec un algorithme d'analyse de corrélation sous-pixel des images de chatoiement laser, qui permet de discriminer et de quantifier les zones d'activité au sein de la colonie. Le signal de speckle est en bonne corrélation avec le taux de croissance des colonies et dépend du nombre de cellules par colonie (voir Figs. 3 et 4).

Une certaine dispersion des paramètres enregistrés par l'imagerie de speckle (largeur de l'anneau d'activité, distance maximale de migration depuis le centre, courbes de croissance des colonies microbiennes) est observée, qui pourrait être attribuée aux changements de propriétés des milieux gélosés, à la variabilité biologique de l'échantillon et/ ou la précision des mesures.

On sait que les plaques de gélose ont tendance à perdre de l'eau (se dessécher) pendant la culture microbienne25. La formation et la force du signal de chatoiement peuvent être affectées par le dessèchement du milieu de gélose. Selon nos observations, dans de nombreuses expériences au cours des 3 à 5 premières heures, des effets associés au séchage du milieu gélosé pourraient se produire. Cependant : (1) Cet effet s'est répandu dans la boîte de Pétri comme une "vague" puis a disparu sans provoquer d'effets supplémentaires. (2) L'effet observé de "séchage" s'est produit beaucoup plus tôt que la formation des "anneaux". En conséquence, même si un séchage apparaissait, cet effet n'affectait pas la formation d'anneaux. Un exemple de l'effet de séchage est illustré à la Fig. 11. Par ailleurs, Sandle et al. ont observé une perte de poids plus importante au tout début (0–4 h) de la culture plutôt qu'à la fin.

Imagerie de chatoiement de la gélose de séchage (milieu gélosé sans bactéries) dans une boîte de Pétri.

La croissance des colonies sur le milieu gélosé était similaire après que les colonies d'inoculation aient tendance à avoir le même taux de croissance initial (voir Fig. 3) et que leur croissance ait divergé les unes des autres plus tard : les colonies ont cessé de croître à des moments différents. Étant donné que l'attribution des colonies sur la plaque était aléatoire - avec un nombre variable de colonies voisines, l'épuisement des ressources et par la suite l'arrêt de la croissance pour chaque colonie pouvait se produire à des moments différents. Néanmoins, chaque colonie présentait un anneau d'activité avec une migration caractéristique loin du centre et une cessation au fil du temps lorsque la croissance active diminue (voir Fig. 12).

Le signal de l'anneau d'activité cesse avec le temps dans les colonies vieillissantes de Vibrio natriegens. En haut : images de speckle de colonie, En bas : image après application de l'algorithme de corrélation de sous-pixels, anneau de cessation d'activité.

Lorsqu'une colonie a cessé d'être active, elle est toujours visible sur les images brutes de speckle (Fig. 12 (en haut)) mais cesse de démontrer un effet d'anneau (Fig. 12 (en bas)). Ainsi, il est conclu que les "anneaux" ne sont pas des phénomènes aléatoires liés à la dessiccation de l'agar, ni un artefact du bord de la colonie, mais un signal d'activité microbienne, qui disparaîtrait lorsque la colonie cesserait de croître.

La technique de speckle proposée permet d'identifier et d'enregistrer la dynamique de la largeur de la zone d'activité tout au long de la croissance de la micro et macro colonie. À l'avenir, l'enregistrement de la croissance des colonies à l'aide du chatoiement laser pourrait devenir un outil attrayant et non invasif pour quantifier la dynamique de croissance et l'activité de prolifération avec une résolution de sous-colonie.

La méthode d'imagerie speckle fournit plus d'informations sur l'activité microbienne au sein des colonies que les séries d'imagerie standard sous lumière blanche.

Il a été démontré que la technique d'imagerie laser speckle est une méthode véritablement non invasive, permettant de surveiller la croissance ininterrompue des colonies microbiennes (le taux de croissance des colonies sous le système de speckle était statistiquement indiscernable de la croissance microbienne dans les conditions de référence). Après application de l'algorithme de corrélation des sous-pixels (« Algorithme de conversion de l'image de speckle en signaux temporels »), le temps d'apparition maximal du signal de speckle était proportionnel au nombre de cellules dans la colonie (Fig. 4).

L'analyse des sous-pixels de corrélation sensible a révélé qu'il existe une zone d'activité distincte au sein de la colonie qui migre du centre vers les bords pendant la croissance de la colonie. Nous avons observé un schéma similaire de migration de la zone d'activité ("anneau") dans les colonies de trois espèces microbiennes différentes. De plus, nous avons observé la présence de l'anneau dans chaque colonie en croissance active (voir Fig. S1 supplémentaire). La vitesse de migration de «l'anneau» variait selon les différentes espèces microbiennes et reflétait ainsi leurs différents taux de croissance typiques pour chacune de ces espèces.

L'imagerie de chatoiement est une technologie prometteuse et puissante qui a permis pour la première fois de visualiser les zones d'activité au sein de la colonie microbienne. Auparavant, la présence de ces zones était prédite mathématiquement. L'étude actuelle suggère également les moyens potentiels de développer davantage la technologie d'imagerie du chatoiement pour les études de colonies microbiennes : augmenter la sensibilité des systèmes optiques et électroniques pour la détection du chatoiement, minimiser le bruit, rechercher les options de multiplexage de la technologie. Cela permettrait d'enregistrer l'activité de prolifération microbienne le plus tôt possible, ainsi que de détecter les colonies à croissance lente et d'identifier l'activité microbienne au sein de la colonie, ce qui rend la technique proposée adaptée à de nombreuses applications directes dans la recherche et le développement, la médecine et l'épidémiologie.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Cette recherche est financée par le projet FEDER "Système basé sur l'apprentissage automatique rapide et rentable pour l'analyse de la croissance des microorganismes" (convention n°1.1.1.1/19/A/147).

Faculté d'informatique et de technologie de l'information, Département de contrôle informatique et de réseaux informatiques, Université technique de Riga, Zunda Krastmala 10, LV-1048, Riga, Lettonie

Ilya Balmages & Dmitrijs Bliznuks

Laboratorija Auctoritas Ltd, Čiekurkalna 1. linija 11, Riga, LV-1026, Lettonie

Ilya Balmages, Ernests Tomas Auzins & Edgars Baranovics

Institut de microbiologie et de biotechnologie, Université de Lettonie, Jelgavas str. 1, Riga, LV-1004, Lettonie

Janis Liepins & Ernests Tomas Auzins

Institut de physique atomique et de spectroscopie, Université de Lettonie, Jelgavas str. 3, Riga, LV-1004, Lettonie

Ilze Lihacova & Alexey Lihachev

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Correspondance à Ilya Balmages.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Balmages, I., Liepins, J., Auzins, ET et al. Utilisation de l'analyse de corrélation de sous-pixel d'imagerie de chatoiement pour révéler un mécanisme de croissance de colonies microbiennes. Sci Rep 13, 2613 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29809-0

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Reçu : 29 août 2022

Accepté : 10 février 2023

Publié: 14 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-29809-0

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